王珊，陈勋，龙雨青，童巧珍，刘湘丹*，周日宝*(1.湖南中医药大学第二附属医院，长沙 410005；2.湖南中医药大学药学院，长沙 410208；.南华大学附属南华医院，湖南 衡阳 421002；4.湖南省中药饮片标准化及功能工程技术研究中心，长沙 410208；5.湖南省普通高等学校中药现代化研究重点实验室，长沙 410208)

    灰毡毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.来源于忍冬科，收载于《中国药典》2020年版山银花项下，具有清热解毒、疏散风热的功效，是临床常用中药之一。自《中国药典》2005年版将金银花与山银花分列后，学者们对两者开展了多项对比研究[1-2]，其中主要活性成分绿原酸的含量测定结果显示，灰毡毛忍冬显著高于忍冬。大量研究表明，绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和抗炎等作用[3]，灰毡毛忍冬作为提取绿原酸的主要原料之一，具有较高的经济价值和良好的市场应用前景。以往提高绿原酸含量的研究多集中在提取工艺和加工炮制等方面[4-5]。近些年，随着分子生物学的快速发展，对灰毡毛忍冬绿原酸生物合成途径的相关基因研究逐渐成为热点。有学者研究发现，绿原酸的生物合成可能与苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、羟基肉桂转移/羟基肉桂酰辅酶A奎尼酸转移酶(HCT/HQT)和香豆酸羟化酶(C3H)等重要酶有关[6]。目前已有关于灰毡毛忍冬HQT基因[4，7]、LmCCoAOMT基因[8]、4CL基因[9]，以及本项目组的PAL1基因[10]和C3H1基因[11]等陆续被克隆，这些基因皆被认为是参与调控绿原酸生物合成途径的关键基因。绿原酸为苯丙素类物质，其合成与苯丙烷代谢密切相关[12]。PAL 作为苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，对绿原酸的合成有着促进作用[13]。

    本研究以灰毡毛忍冬的花、茎和叶为材料，根据项目组前期获得的灰毡毛忍冬转录组数据库的相关序列设计引物，利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和扩增技术(RACE)，克隆灰毡毛忍冬PAL2(LmPAL2)基因，对其进行生物信息学分析。再采用qRT-PCR 技术测定其在不同花期和不同部位的表达量，并进行分析，为进一步探究LmPAL2基因在参与灰毡毛忍冬绿原酸生物合成中的调控作用提供参考依据。

    1 材料

    1.1 药材

    灰毡毛忍冬材料均采摘于湖南中医药大学药植园，取开花进程中的7个花期的花[10]以及茎、叶，经湖南中医药大学周日宝教授鉴定为灰毡毛忍冬的花、茎及叶 ......