龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损的作用
【中图分类号】R285 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2012)01-0011-01
【摘要】 目的]观察龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损创面的促进作用。方法:将人成纤维细胞种植入胶原海绵，人角质形成细胞种植在表层，构建组织工程皮肤，并移植入裸鼠皮肤缺损创面;实验动物随机分为4组，选用"活血圣药"龙血竭于移植后2d分别进行创面外敷、单纯口服、创面外敷+口服治疗，并设空白对照组。组织工程皮肤移植后9d取材检测，观察创面局部表皮厚度、真皮层中层粘连蛋白(Ln)、Ⅰ型胶原蛋白的表达及毛细血管增生情况。结果:龙血竭能促进组织工程皮肤移植后表皮的发育及真皮层中毛细血管的增生,增强Ln、Ⅰ型胶原蛋白的分泌，龙血竭外敷+口服组效果最佳。结论:龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤创面有促进作用。
【关键词】 龙血竭 中西医结合疗法 皮肤移植 细胞培养
大面积的皮肤缺损需要皮肤移植进行修复，皮源不足是最大的问题，许多患者往往因难以实现及时的救护，而导致感染、多器官功能衰竭等严重并发症甚至死亡。组织工程皮肤是利用来源于自体或异体的皮肤细胞，与适宜的真皮支架复合，在体外构建而成的皮肤类似物，将其移植入皮肤缺损创面，修复缺损的皮肤,为解决皮肤移植中的皮源不足问题提供了光明前景。但目前组织工程皮肤移植后存在表皮层薄、血管化进程慢等问题，导致移植成功率低[1]。
, 百拇医药
祖国传统医学在治疗皮肤创伤方面有着悠久的历史，"生肌法"是中医药治疗皮肤创伤的一项重要治则，生肌中药通过"收敛止血、活血化瘀、祛腐生肌"等作用修复缺损的皮肤。本研究将构建的组织工程皮肤移植后，利用活血圣药龙血竭作用于移植处，观察创面微环境的变化，探讨利用生肌中药促进组织工程皮肤修复创面的可能性，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料。高糖DMEM及低糖DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津灏洋生物制品科技有限公司);25cm2塑料培养瓶(Coning公司);胰蛋白酶及II型胶原酶(均为Sigma公司);其他试剂均为国产分析纯。龙血竭购自广州市杏园春大药房;幼儿包皮取自中山一院儿外科无菌切除标本(病人家属知情);人角质形成细胞购自中山大学北校区实验动物中心;胶原海绵购自广州市创尔生物技术有限公司。
1.2 免疫荧光试剂及仪器。Ⅰ抗层粘连蛋白(Ln)(博士得生物试剂公司);Ⅰ型胶原(Sigma公司);Ⅱ抗为红色荧光探针(Cy3)标记的山羊抗小鼠IgG(IgGCy3)，核标记物为二脒基苯基吲哚(DAPI)，均购自Sigma公司;IX71奥林巴斯倒置荧光显微镜(日本)。
, 百拇医药
1.3 实验方法
1.3.1 人皮肤细胞的培养。取无菌切除术后幼儿包皮，于超净工作台上用含青霉素2×105U/L、链霉素200mg/L的磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，尽可能剔除皮下组织，剪成约2mm×2mm小块，置于1g/LⅡ型胶原酶消化液中消化过夜(4℃、约18h)，分离表皮和真皮。将真皮剪碎，然后转移至2.5g/L胰蛋白酶中约15min，以含体积分数10%FBS的高糖DMEM培养液终止消化，1000r/min离心3min，将沉淀物接种于25cm2塑料培养瓶中，以含体积分数10%FBS的高糖DMEM培养液分离培养人包皮成纤维细胞。角质形成细胞以含体积分数10%FBS的低糖DMEM培养液常规培养传代。
1.3.2 组织工程皮肤的构建。将无菌的胶原海绵剪成1cm×1cm×0.2cm小块，放入无菌24孔板内，取第3～5代人包皮成纤维细胞，按1×105个/cm2将细胞种植于胶原海绵两面，体积分数5%CO2、37℃静置培养3～4h。将人角质形成细胞以1×105个/cm2密度接种于单面胶原海绵，无菌培养3～4h。
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1.3.3 组织工程皮肤的移植。SPF级裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/kg剂量)，固定于手术台上，严格消毒后，沿背部正中线左右距脊柱约0.5cm处皮肤呈"C"形切开，形成皮瓣，分离皮下组织至深筋膜，暴露肌层，切口大小约1cm2。将体外构建的组织工程皮肤覆盖到全层皮肤缺损的创面，再用无菌凡士林纱布覆盖，单针缝线固定皮瓣于正常皮肤上，无菌纱布包扎。术后2d拆除敷料，剪掉皮瓣。单笼饲养。
1.3.4 实验分组。实验动物随机分为4组，每组4只，分为龙血竭外敷组(隔天换药)、内服(按70mg·kg-1·d-1剂量灌胃)组、外敷+内服组，不用药者为空白对照组。于术后9d取材检测，单笼饲养。
1.3.5 免疫荧光检测。术后9d取材，连同周边正常皮肤剪去稍许，4℃、40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定6～8h，300g/L蔗糖液中过夜，冰冻切片，片厚8μm，部分行苏木素-伊红(HE)染色，分别行层粘连蛋白(Ln)、Ⅰ型胶原抗体免疫荧光组织化学染色，Ⅰ抗浓度均为1：100。Ⅱ抗IgGCy3浓度为1：100。封片剂为甘油PBS(甘油：PBS体积比为9：1)。
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免疫荧光组织化学染色步骤：冰冻切片，PBS(0.01mol/L，pH=7.4)洗3遍;体积分数3%正常羊血清封闭，室温，30min;分别加Ⅰ抗Ln、Ⅰ型胶原，4℃过夜后PBS洗3遍;加Ⅱ抗山羊抗小鼠IgGCy3室温下孵育1h后PBS洗3遍;DAPI复染核15min;甘油PBS封片，荧光显微镜观察。
2 结果
2.1 各组组织学检测结果。空白对照组：创面处皮肤表皮较正常皮肤厚,基底层与真皮层交界局部连接欠佳。龙血竭治疗各组标本表皮细胞分层明显，排列整齐，表皮和真皮连接紧密，真皮层中有毛细血管增生，龙血竭外用+内服组真皮层中新生毛细血管最丰富。空白对照组及各实验组均未观察到汗腺、皮脂腺等皮肤附属器结构。
2.2 免疫荧光检测结果。组织工程皮肤移植后9d，空白对照组标本真皮层中有少量散在Ln表达阳性细胞，表皮真皮交界处可见Ln表达阳性。龙血竭治疗各组标本真皮层中Ln表达阳性细胞增多增强，表皮真皮交界处亦可见Ln表达阳性，其中外敷+内服组Ln呈明显的连续性表达。
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组织工程皮肤移植后9d，空白对照组标本真皮层中可见散在Ⅰ型胶原表达阳性细胞。龙血竭治疗各组标本真皮层中Ⅰ型胶原表达阳性细胞增多，龙血竭外用+内服组真皮层中DAPi标记细胞Ⅰ型胶原表达最为明显。
3 讨论
组织工程皮肤的出现不仅可以解决因各种原因引起的皮肤缺损问题，而且在治疗瘢痕挛缩及整形美容等领域都有重要的应用价值，"生肌法"是祖国传统医学在医疗实践中形成的重要治则，时至今日仍显示出独特的优势，但生肌中药应用于组织工程皮肤的研究尚未查及。
血竭(Sanguis draxonis)是中药外治皮肤损伤中最常用的生肌药物[2]，古人对血竭的效用极为推崇，在李时珍的《本草纲目》中已有详细记载：血竭性平，味甘、咸，无毒，归心、肝、肾三经，具有活血化瘀、祛腐生肌、消炎镇痛、止血敛疮、软坚散结等作用，被誉为"活血圣药"。
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皮肤创面修复是一个复杂的生物学过程，现代医学研究认为皮肤创面修复是局部炎症反应、成纤维细胞增殖并分泌大量细胞外基质、新生血管长入缺损部位及表皮细胞迁移、增殖、分化、重新覆盖创面等过程综合作用的结果[3]。
细胞外基质主要包括胶原、层粘连蛋白(laminin，Ln)、纤维结合蛋白(fibronectin，Fn)、氨基葡聚糖和蛋白聚糖等成分。胶原是细胞外基质的主要成分，Ⅰ型胶原可促进表皮细胞的迁移，使创面再上皮化，上皮化过程又可抑制胶原的过度增生，减少瘢痕的形成，在创面修复及瘢痕治疗中具有重要意义。Ln是基膜的主要成分，基膜位于表皮和真皮之间，在创面愈合过程中能使表皮与真皮结合得更加牢固，并使再上皮化的过程得以终止[4]，因此基膜重建及功能正常化是组织工程皮肤修复创面的一个重要指标。
本研究结果显示，龙血竭作用于组织工程皮肤移植后的动物模型，在炎症早期能促进Ln、Ⅰ型胶原等细胞外基质成分增加，提示龙血竭能促进皮肤细胞的增殖分化及分泌，并促进毛细血管重新生成，血供增加，进而促进组织工程皮肤对皮肤创面的修复。利用中药的生肌功效有望改进或解决目前组织工程皮肤研究中存在的血管化进程慢、移植成功率低等问题。
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参考文献
[1] Anthony D Metcalfe,Mark W J Ferguson.Bioengineering skin using mechanismsof regeneration and repair[J].Biomaterials，2007，28(34)：5100.
[2] 颜燕艮，何振辉.古籍文献中以生肌功效命名的外用古方浅析[J].广州中医药大学学报，2002，19(3)：234.
[3] 金岩.组织工程学原理与技术[M].西安：第四军医大学出版社，2004：68.
[4] Aumailley M，khal A E，Knss N，et al.Laminin 5 processing and its integrationinto the ECM[J].Matrix Biology，2003，22(1)：49., http://www.100md.com(张红)
【摘要】 目的]观察龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损创面的促进作用。方法:将人成纤维细胞种植入胶原海绵，人角质形成细胞种植在表层，构建组织工程皮肤，并移植入裸鼠皮肤缺损创面;实验动物随机分为4组，选用"活血圣药"龙血竭于移植后2d分别进行创面外敷、单纯口服、创面外敷+口服治疗，并设空白对照组。组织工程皮肤移植后9d取材检测，观察创面局部表皮厚度、真皮层中层粘连蛋白(Ln)、Ⅰ型胶原蛋白的表达及毛细血管增生情况。结果:龙血竭能促进组织工程皮肤移植后表皮的发育及真皮层中毛细血管的增生,增强Ln、Ⅰ型胶原蛋白的分泌，龙血竭外敷+口服组效果最佳。结论:龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤创面有促进作用。
【关键词】 龙血竭 中西医结合疗法 皮肤移植 细胞培养
大面积的皮肤缺损需要皮肤移植进行修复，皮源不足是最大的问题，许多患者往往因难以实现及时的救护，而导致感染、多器官功能衰竭等严重并发症甚至死亡。组织工程皮肤是利用来源于自体或异体的皮肤细胞，与适宜的真皮支架复合，在体外构建而成的皮肤类似物，将其移植入皮肤缺损创面，修复缺损的皮肤,为解决皮肤移植中的皮源不足问题提供了光明前景。但目前组织工程皮肤移植后存在表皮层薄、血管化进程慢等问题，导致移植成功率低[1]。
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祖国传统医学在治疗皮肤创伤方面有着悠久的历史，"生肌法"是中医药治疗皮肤创伤的一项重要治则，生肌中药通过"收敛止血、活血化瘀、祛腐生肌"等作用修复缺损的皮肤。本研究将构建的组织工程皮肤移植后，利用活血圣药龙血竭作用于移植处，观察创面微环境的变化，探讨利用生肌中药促进组织工程皮肤修复创面的可能性，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料。高糖DMEM及低糖DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(FBS，天津灏洋生物制品科技有限公司);25cm2塑料培养瓶(Coning公司);胰蛋白酶及II型胶原酶(均为Sigma公司);其他试剂均为国产分析纯。龙血竭购自广州市杏园春大药房;幼儿包皮取自中山一院儿外科无菌切除标本(病人家属知情);人角质形成细胞购自中山大学北校区实验动物中心;胶原海绵购自广州市创尔生物技术有限公司。
1.2 免疫荧光试剂及仪器。Ⅰ抗层粘连蛋白(Ln)(博士得生物试剂公司);Ⅰ型胶原(Sigma公司);Ⅱ抗为红色荧光探针(Cy3)标记的山羊抗小鼠IgG(IgGCy3)，核标记物为二脒基苯基吲哚(DAPI)，均购自Sigma公司;IX71奥林巴斯倒置荧光显微镜(日本)。
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1.3 实验方法
1.3.1 人皮肤细胞的培养。取无菌切除术后幼儿包皮，于超净工作台上用含青霉素2×105U/L、链霉素200mg/L的磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，尽可能剔除皮下组织，剪成约2mm×2mm小块，置于1g/LⅡ型胶原酶消化液中消化过夜(4℃、约18h)，分离表皮和真皮。将真皮剪碎，然后转移至2.5g/L胰蛋白酶中约15min，以含体积分数10%FBS的高糖DMEM培养液终止消化，1000r/min离心3min，将沉淀物接种于25cm2塑料培养瓶中，以含体积分数10%FBS的高糖DMEM培养液分离培养人包皮成纤维细胞。角质形成细胞以含体积分数10%FBS的低糖DMEM培养液常规培养传代。
1.3.2 组织工程皮肤的构建。将无菌的胶原海绵剪成1cm×1cm×0.2cm小块，放入无菌24孔板内，取第3～5代人包皮成纤维细胞，按1×105个/cm2将细胞种植于胶原海绵两面，体积分数5%CO2、37℃静置培养3～4h。将人角质形成细胞以1×105个/cm2密度接种于单面胶原海绵，无菌培养3～4h。
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1.3.3 组织工程皮肤的移植。SPF级裸鼠用40mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉(按10mL/kg剂量)，固定于手术台上，严格消毒后，沿背部正中线左右距脊柱约0.5cm处皮肤呈"C"形切开，形成皮瓣，分离皮下组织至深筋膜，暴露肌层，切口大小约1cm2。将体外构建的组织工程皮肤覆盖到全层皮肤缺损的创面，再用无菌凡士林纱布覆盖，单针缝线固定皮瓣于正常皮肤上，无菌纱布包扎。术后2d拆除敷料，剪掉皮瓣。单笼饲养。
1.3.4 实验分组。实验动物随机分为4组，每组4只，分为龙血竭外敷组(隔天换药)、内服(按70mg·kg-1·d-1剂量灌胃)组、外敷+内服组，不用药者为空白对照组。于术后9d取材检测，单笼饲养。
1.3.5 免疫荧光检测。术后9d取材，连同周边正常皮肤剪去稍许，4℃、40g/L多聚甲醛(pH7.4)固定6～8h，300g/L蔗糖液中过夜，冰冻切片，片厚8μm，部分行苏木素-伊红(HE)染色，分别行层粘连蛋白(Ln)、Ⅰ型胶原抗体免疫荧光组织化学染色，Ⅰ抗浓度均为1：100。Ⅱ抗IgGCy3浓度为1：100。封片剂为甘油PBS(甘油：PBS体积比为9：1)。
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免疫荧光组织化学染色步骤：冰冻切片，PBS(0.01mol/L，pH=7.4)洗3遍;体积分数3%正常羊血清封闭，室温，30min;分别加Ⅰ抗Ln、Ⅰ型胶原，4℃过夜后PBS洗3遍;加Ⅱ抗山羊抗小鼠IgGCy3室温下孵育1h后PBS洗3遍;DAPI复染核15min;甘油PBS封片，荧光显微镜观察。
2 结果
2.1 各组组织学检测结果。空白对照组：创面处皮肤表皮较正常皮肤厚,基底层与真皮层交界局部连接欠佳。龙血竭治疗各组标本表皮细胞分层明显，排列整齐，表皮和真皮连接紧密，真皮层中有毛细血管增生，龙血竭外用+内服组真皮层中新生毛细血管最丰富。空白对照组及各实验组均未观察到汗腺、皮脂腺等皮肤附属器结构。
2.2 免疫荧光检测结果。组织工程皮肤移植后9d，空白对照组标本真皮层中有少量散在Ln表达阳性细胞，表皮真皮交界处可见Ln表达阳性。龙血竭治疗各组标本真皮层中Ln表达阳性细胞增多增强，表皮真皮交界处亦可见Ln表达阳性，其中外敷+内服组Ln呈明显的连续性表达。
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组织工程皮肤移植后9d，空白对照组标本真皮层中可见散在Ⅰ型胶原表达阳性细胞。龙血竭治疗各组标本真皮层中Ⅰ型胶原表达阳性细胞增多，龙血竭外用+内服组真皮层中DAPi标记细胞Ⅰ型胶原表达最为明显。
3 讨论
组织工程皮肤的出现不仅可以解决因各种原因引起的皮肤缺损问题，而且在治疗瘢痕挛缩及整形美容等领域都有重要的应用价值，"生肌法"是祖国传统医学在医疗实践中形成的重要治则，时至今日仍显示出独特的优势，但生肌中药应用于组织工程皮肤的研究尚未查及。
血竭(Sanguis draxonis)是中药外治皮肤损伤中最常用的生肌药物[2]，古人对血竭的效用极为推崇，在李时珍的《本草纲目》中已有详细记载：血竭性平，味甘、咸，无毒，归心、肝、肾三经，具有活血化瘀、祛腐生肌、消炎镇痛、止血敛疮、软坚散结等作用，被誉为"活血圣药"。
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皮肤创面修复是一个复杂的生物学过程，现代医学研究认为皮肤创面修复是局部炎症反应、成纤维细胞增殖并分泌大量细胞外基质、新生血管长入缺损部位及表皮细胞迁移、增殖、分化、重新覆盖创面等过程综合作用的结果[3]。
细胞外基质主要包括胶原、层粘连蛋白(laminin，Ln)、纤维结合蛋白(fibronectin，Fn)、氨基葡聚糖和蛋白聚糖等成分。胶原是细胞外基质的主要成分，Ⅰ型胶原可促进表皮细胞的迁移，使创面再上皮化，上皮化过程又可抑制胶原的过度增生，减少瘢痕的形成，在创面修复及瘢痕治疗中具有重要意义。Ln是基膜的主要成分，基膜位于表皮和真皮之间，在创面愈合过程中能使表皮与真皮结合得更加牢固，并使再上皮化的过程得以终止[4]，因此基膜重建及功能正常化是组织工程皮肤修复创面的一个重要指标。
本研究结果显示，龙血竭作用于组织工程皮肤移植后的动物模型，在炎症早期能促进Ln、Ⅰ型胶原等细胞外基质成分增加，提示龙血竭能促进皮肤细胞的增殖分化及分泌，并促进毛细血管重新生成，血供增加，进而促进组织工程皮肤对皮肤创面的修复。利用中药的生肌功效有望改进或解决目前组织工程皮肤研究中存在的血管化进程慢、移植成功率低等问题。
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参考文献
[1] Anthony D Metcalfe,Mark W J Ferguson.Bioengineering skin using mechanismsof regeneration and repair[J].Biomaterials，2007，28(34)：5100.
[2] 颜燕艮，何振辉.古籍文献中以生肌功效命名的外用古方浅析[J].广州中医药大学学报，2002，19(3)：234.
[3] 金岩.组织工程学原理与技术[M].西安：第四军医大学出版社，2004：68.
[4] Aumailley M，khal A E，Knss N，et al.Laminin 5 processing and its integrationinto the ECM[J].Matrix Biology，2003，22(1)：49., http://www.100md.com(张红)