TritonX—100诱导的嗅觉障碍大鼠嗅球中β—Netrin mRNA的表达x(1)
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摘要：目的：(1)建立化学损伤诱导的嗅觉障碍大鼠模型，用行为学方法观察其嗅觉变化。(2)观察嗅觉恢复过程中大鼠嗅粘膜和嗅球的组织学变化。(3)检查嗅觉恢复过程中β-Netrin mRNA在大鼠嗅球中的表达变化。方法：40只出生40d的健康SD大鼠经行为学检查训练后，随机取30只以TritonX-100进行造模，造模后次日进行行为学检查，共获得24只造模成功的大鼠，将其归为M组，另10只大鼠用生理盐水进行假造模，作为对照组。所有大鼠以每6d为一轮，进行行为学检查。于30d、45d随机选择8只M组大鼠处死取材，于60d时处死对照组及剩余8只M组大鼠，分别取嗅粘膜和嗅球进行进一步检查。嗅粘膜进行HE染色，嗅球则做电镜和原位杂交检验。结果：(1)行为学检查：两种行为学方法，双瓶实验(TBE)，埋藏食物小球实验(BFPT)均提示大鼠嗅觉逐渐恢复。(2)嗅球的组织学检查显示嗅球会受到继发性损伤，可见线粒体增多，大小不一，线粒体嵴部分缺失，其他细胞器减少。细胞膜部分损伤，胞内可见空泡及坏死细胞碎片，细胞连接欠紧密，细胞间隙增宽。(3)原位杂交评分示：对照组得分为3.0±0，30d组为4.75±0.5，45d组为6.5±0.577，60d组为4.25±0.5。经单因素方差分析法计算各相邻组间结果有统计学差异。结论：(1)TritonX-100鼻腔灌注可引发大鼠嗅觉丧失。TBE及BFPT检查确切有效。(2)嗅觉和嗅球的病理改变均可恢复。(3)β-Netrin mRNA在大鼠嗅球中的表达随着大鼠嗅觉功能的恢复有一定的变化，表现为阳性信号增强，其中造模后45d左右较强，提示β-Netrin可能在嗅觉恢复过程中起到一定的作用。
关键词：嗅觉障碍；嗅球；行为学检查；原位杂交；β-Netrin
【中图分类号】Q189【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2012)11-0009-02
嗅觉是生物基本感觉之一，在生物的进化过程中，嗅觉在寻找食物及逃避危险中起到了很重要的作用，对于某些生物而言，嗅觉极其重要，甚至于超过其视觉、听觉等其它感觉。近几年随着人们对生活质量要求的提高，对嗅觉障碍的关注程度也有了很大的提高。嗅觉障碍的恢复与治疗根据产生原因不同效果差距也较大，鼻腔炎症性疾病及其他局部原因(如鼻息肉、鼻甲肥大等)造成的嗅觉障碍治疗效果较好。而其他原因如外伤、化学损伤、病毒感染等造成的嗅觉障碍预后相对较差。
β-netrin为netrin家族中的一个成员，它非常依赖于与层粘连蛋白的β链，故命名为β-netrin，在Manuel Koch等的实验中已经证实该蛋白有刺激神经突起诱向生长的活性[1]。孟凡伟等用地高辛标记的cRNA探针利用组织原位杂交技术检测β-Netrin mRNA在出生后30 d大鼠脑内的表达及其分布。发现该mRNA主要定位于神经元，阳性细胞广泛分布于大脑皮层、边缘系统、小脑、脑干、嗅球等处。故认为其有可能参与了嗅觉突触联系的形成及学习记忆有关突触的建立[2]。
1材料和方法
1.1实验动物和造模方法：40只健康SD大鼠，雌雄不限。生后40余天，体重180-220g。购于东南大学医学院实验动物中心。将40只健康SD大鼠随机分为正常组(Normal group，N组)，及造模组(Model group，M组)。其中N组10只，M组30只。动物模型的建立：将大鼠麻醉后用微量移液器向其双侧鼻腔分别灌注07% TritonX-100各0.1ml，灌注时间为1分钟。对造组大鼠以生理盐水代替。
1.2嗅觉检查：本实验中采取两种经典的行为学方法：找寻食物小球实验(BFPT)、双瓶实验(TBE)对大鼠进行嗅觉检查。每六天为一轮，共进行十轮行为学检查。
1.2.1找寻食物小球实验：
(1)训练阶段：将实验用盒子(大小约45cm×24cm×20cm)中铺上3cm左右厚度的垫料，垫料密度尽量均匀，将食物小球随机埋藏于垫料中，距表面0.5cm左右，放入限食后的大鼠，使其寻找到该食物小球，然后根据其寻找所需时间逐渐把食物小球埋藏深度加大，使其寻找时间在60s-180s之间，经反复预实验发现在本实验室条件下埋藏距离在0.8cm左右较为合适。逐个训练大鼠，直至所有大鼠均能在2分钟以内寻找出埋藏于0.8cm深垫料下的食物小球。
(2)检查阶段：经训练及造模后的大鼠在造模次日进行实验，为避免昼夜节奏变化影响，本实验均于晚间6-8点进行(实验前禁食8小时左右)。记录其找到食物小球的时间(T值)，若找到食物小球时间超过300s，则取出大鼠，认为其存在嗅觉障碍，每次连续操作5次。
1.2.2双瓶实验：
(1)训练阶段：实验前所有水瓶装100ml水，放置于无大鼠的笼子上，24小时以后记录其自流量，若大于5ml，则更换水瓶。每个笼子准备两个水瓶，两个瓶中都装100ml的饮用水，两个瓶子每隔24小时就互换一次，并记录两个瓶中被进食的水量，让大鼠能平均的饮用两个瓶中的水。
(2)检查阶段：经过训练的大鼠经造模后进入该实验检查阶段，进入检查阶段的大鼠必须每只单独使用一只鼠笼，操作步骤同上，其中一个瓶中依旧使用饮用水，但另个瓶中改用1mmol/L的HCl，记录每日各瓶中液体消耗量 ......
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