趋化因子受体CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达及其临床意义
(1.青岛大学医学院；2.山东省泰安市中心医院 山东泰安 271000)
[摘 要] 目的检测结肠癌患者外周血中CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达，分析CCR7的表达与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的相关性。方法利用流式细胞仪检测44例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测CCR7的阳性表达率。比较结肠癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7的表达情况；比较患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7表达阳性率变化；比较CD3+CD8+T细胞亚群上CCR7表达在术前、术后的变化。结果结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比正常人低，差异有统计学意义(P<0.05)；术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高，差异有统计学意义(P<0.05)。外周血CCR7的表达与结肠癌肿瘤的大小、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移等具有显著相关(P<0.05)。结论CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上高度表达，并与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的密切相关。CCR7的表达可能与促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质有关。
, 百拇医药
[关键词]结肠癌；趋化因子；CCR7；外周血；T细胞；流式细胞术
[中图分类号] R735.3+5[文献标识码] A[文章编号] 1672-4208(2008)21-0034-02
趋化因子(chemokine)是由组织细胞或炎性细胞衍生的、具有白细胞趋化活性的肽分子，其能选择性地引导白细胞亚群的定向游走和组织内集聚。根据趋化因子的氨基酸序列，将趋化因子分为四个亚家族，即CXC、CC、C和CX3C亚家族[1]。CXC亚家族有IL-8、IP-10，CC亚家族有MCP 1~5等。已有研究表明，趋化因子与许多疾病如肺部的支气管扩张、特发性肺动脉纤维化、风湿病、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等均有密切关系[2]。由于肿瘤组织存在浸润的免疫细胞，趋化因子与肿瘤的关系受到关注。但是由于结肠癌临床的异质性表现，迄今为止尚缺乏有效理想的肿瘤标志物，因此寻找敏感性、特应性高的结肠癌标志物，以提高结肠癌的早期诊断、疗效评价和预测预后尤为重要。本研究就是利用流式细胞仪技术检测趋化因子受体(chemokine receptor)CCR7在结肠癌患者术前、术后外周血记忆型T细胞亚群上的表达情况，并与正常人相对照，通过与肿瘤免疫逃逸有关的表面抗原以及细胞因子等的检测，为结肠癌临床标志物的筛选、结肠癌发病机制的探讨以及结肠癌的综合防治提供有价值的线索。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 FACScaliur流式细胞仪：美国BD公司。KDC-160HR低温高速离心机：科大创新中佳分公司。可调式微量移液器：德国Eppendrof公司。CELLQuest获取和分析软件：美国BD公司。鼠抗人CD8-FITC、CD3-PE-cy5、CCR7-PE单克隆抗体、溶血素、Falcon管均购自美国BD公司。0.5 M EDTA、PBS缓冲液、Tip头及其他常规试剂与耗材均为国产。1.2 标本来源及分组 44例结肠癌患者为泰安市中心医院2007年4月～2007年10月住院病人，其中男性34例，女性10例，年龄45~74岁，平均年龄57岁。常规根治手术后按照UICC 1997年结肠癌PTMN分期法进行分期。正常对照组44例选自我院健康查体者，经结肠镜取材并经病理证实无胃部疾病。其中男性32例，女性12例，年龄34~84岁，平均年龄59岁。
1.3 标本的留取及制备 术前2d清晨空腹抽取肘静脉血2 ml置EDTA抗凝无菌试管中送中心实验室做流式检测CCR7表达情况。术后7d再次抽血检测，并查看病人病理情况。将病人按编号在“临床病例登记信息表”中记录其姓名、性别、年龄、住院号、籍贯、家族史、饮食习惯、临床诊断、病理号、病理描述、临床分期、CEA、CA19-9、CA242。
, 百拇医药
1.4 研究方法及操作步骤 (1)加入标本血。收集结肠癌患者术前、术后以及正常人外周血，分离PBMC后，在Falcon管中各加入5 μl CCR7-PE、5 μlCD3-PE-Cy5和10 μlCD8-FITC标记的抗体，每管加入50 μl细胞悬液(5×105)，充分混匀后，室温避光孵育15 min。同时设同型阴性对照管，只加入50 μl细胞悬液。(2)加入溶血素，室温避光8 min。(3)1000 r/min离心5 min，弃上清，再加入0.9%生理盐水4 ml混匀。(4)重复步骤(3)。(5)1000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μl生理盐水，上机检测。(6)流式细胞仪检测结果，以CELLQuest软件获取细胞，设立同型阴性对照，调整电压，设立淋巴细胞门，检测淋巴细胞数量和CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率。
1.5 检测及数据采集 利用流式细胞仪检测每一例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测趋化因子受体CCR7的阳性表达率。
, 百拇医药
1.6 实验结果的统计学分析 采用ANOVA方差分析，以SAS 9.0统计软件对实验结果进行统计学分析。比较结肠癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况；比较结肠癌患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7表达阳性率变化；比较CD3+CD8+T细胞亚群上CCR7在术前、术后的变化。分析结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况与结肠癌肿瘤的大小、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移的相关性。
2 结果与分析
我们在检测趋化因子受体CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达情况时，发现获取的大部分CD3+CD8+T细胞可以根据CD8+分子表达强度分为两个亚群：低密度群和高密度群。首先从整体上分析CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达情况，然后对每个亚群单独分析，比较术前、术后亚群的变化。
2.1 患者组与正常对照组整群检测结果 整群三组间采用ANOVA分析，F＝10.13，P<0.0001；术前组与术后组比较，P<0.05，有统计学意义，可以认为结肠癌患者术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高；正常对照组与结肠癌患者组比较，P<0.05，有统计学意义，可以认为正常对照组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比患者组高。见表1。, 百拇医药(王 磊 齐新颜 高 磊)
[摘 要] 目的检测结肠癌患者外周血中CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达，分析CCR7的表达与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的相关性。方法利用流式细胞仪检测44例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测CCR7的阳性表达率。比较结肠癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7的表达情况；比较患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7表达阳性率变化；比较CD3+CD8+T细胞亚群上CCR7表达在术前、术后的变化。结果结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比正常人低，差异有统计学意义(P<0.05)；术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高，差异有统计学意义(P<0.05)。外周血CCR7的表达与结肠癌肿瘤的大小、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移等具有显著相关(P<0.05)。结论CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上高度表达，并与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的密切相关。CCR7的表达可能与促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质有关。
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[关键词]结肠癌；趋化因子；CCR7；外周血；T细胞；流式细胞术
[中图分类号] R735.3+5[文献标识码] A[文章编号] 1672-4208(2008)21-0034-02
趋化因子(chemokine)是由组织细胞或炎性细胞衍生的、具有白细胞趋化活性的肽分子，其能选择性地引导白细胞亚群的定向游走和组织内集聚。根据趋化因子的氨基酸序列，将趋化因子分为四个亚家族，即CXC、CC、C和CX3C亚家族[1]。CXC亚家族有IL-8、IP-10，CC亚家族有MCP 1~5等。已有研究表明，趋化因子与许多疾病如肺部的支气管扩张、特发性肺动脉纤维化、风湿病、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等均有密切关系[2]。由于肿瘤组织存在浸润的免疫细胞，趋化因子与肿瘤的关系受到关注。但是由于结肠癌临床的异质性表现，迄今为止尚缺乏有效理想的肿瘤标志物，因此寻找敏感性、特应性高的结肠癌标志物，以提高结肠癌的早期诊断、疗效评价和预测预后尤为重要。本研究就是利用流式细胞仪技术检测趋化因子受体(chemokine receptor)CCR7在结肠癌患者术前、术后外周血记忆型T细胞亚群上的表达情况，并与正常人相对照，通过与肿瘤免疫逃逸有关的表面抗原以及细胞因子等的检测，为结肠癌临床标志物的筛选、结肠癌发病机制的探讨以及结肠癌的综合防治提供有价值的线索。
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1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 FACScaliur流式细胞仪：美国BD公司。KDC-160HR低温高速离心机：科大创新中佳分公司。可调式微量移液器：德国Eppendrof公司。CELLQuest获取和分析软件：美国BD公司。鼠抗人CD8-FITC、CD3-PE-cy5、CCR7-PE单克隆抗体、溶血素、Falcon管均购自美国BD公司。0.5 M EDTA、PBS缓冲液、Tip头及其他常规试剂与耗材均为国产。1.2 标本来源及分组 44例结肠癌患者为泰安市中心医院2007年4月～2007年10月住院病人，其中男性34例，女性10例，年龄45~74岁，平均年龄57岁。常规根治手术后按照UICC 1997年结肠癌PTMN分期法进行分期。正常对照组44例选自我院健康查体者，经结肠镜取材并经病理证实无胃部疾病。其中男性32例，女性12例，年龄34~84岁，平均年龄59岁。
1.3 标本的留取及制备 术前2d清晨空腹抽取肘静脉血2 ml置EDTA抗凝无菌试管中送中心实验室做流式检测CCR7表达情况。术后7d再次抽血检测，并查看病人病理情况。将病人按编号在“临床病例登记信息表”中记录其姓名、性别、年龄、住院号、籍贯、家族史、饮食习惯、临床诊断、病理号、病理描述、临床分期、CEA、CA19-9、CA242。
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1.4 研究方法及操作步骤 (1)加入标本血。收集结肠癌患者术前、术后以及正常人外周血，分离PBMC后，在Falcon管中各加入5 μl CCR7-PE、5 μlCD3-PE-Cy5和10 μlCD8-FITC标记的抗体，每管加入50 μl细胞悬液(5×105)，充分混匀后，室温避光孵育15 min。同时设同型阴性对照管，只加入50 μl细胞悬液。(2)加入溶血素，室温避光8 min。(3)1000 r/min离心5 min，弃上清，再加入0.9%生理盐水4 ml混匀。(4)重复步骤(3)。(5)1000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μl生理盐水，上机检测。(6)流式细胞仪检测结果，以CELLQuest软件获取细胞，设立同型阴性对照，调整电压，设立淋巴细胞门，检测淋巴细胞数量和CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率。
1.5 检测及数据采集 利用流式细胞仪检测每一例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测趋化因子受体CCR7的阳性表达率。
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1.6 实验结果的统计学分析 采用ANOVA方差分析，以SAS 9.0统计软件对实验结果进行统计学分析。比较结肠癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况；比较结肠癌患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7表达阳性率变化；比较CD3+CD8+T细胞亚群上CCR7在术前、术后的变化。分析结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况与结肠癌肿瘤的大小、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移的相关性。
2 结果与分析
我们在检测趋化因子受体CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达情况时，发现获取的大部分CD3+CD8+T细胞可以根据CD8+分子表达强度分为两个亚群：低密度群和高密度群。首先从整体上分析CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达情况，然后对每个亚群单独分析，比较术前、术后亚群的变化。
2.1 患者组与正常对照组整群检测结果 整群三组间采用ANOVA分析，F＝10.13，P<0.0001；术前组与术后组比较，P<0.05，有统计学意义，可以认为结肠癌患者术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高；正常对照组与结肠癌患者组比较，P<0.05，有统计学意义，可以认为正常对照组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比患者组高。见表1。, 百拇医药(王 磊 齐新颜 高 磊)