南昌地区婴幼儿轮状病毒肠炎G血清型的流行病学研究(1)
【摘要】 目的：研究南昌地区5岁以下婴幼儿轮状病毒肠炎G血清型的流行病学。方法：对2007年1月-2009年12月在江西省儿童医院就诊的5岁以下腹泻患儿进行抽样调查，收集腹泻患儿粪便标本检测轮状病毒，并对轮状病毒阳性标本用逆转录PCR进行G血清型的分型研究。结果：共检测标本286份，其中轮状病毒阳性标本132份，检出率为46.1%；血清分型发现，轮状病毒肠炎G分型以G1 (41.9% )和G3(28.9% )为主要流行株，未分型病毒株占22.3%。结论：提示南昌地区婴幼儿轮状病毒肠炎的病原体以G1型和G3型轮状病毒最多见， G1型和G3型可作为南昌地区轮状病毒疫苗研制的主要血清型。
【关键词】 轮状病毒腹泻；婴幼儿轮状病毒肠炎流行病学；分子 G血清型
人轮状病毒(HRV)是临床中比较常见的一种病毒，是诱发婴幼儿腹泻的一种重要病毒，而且多在5岁以下的儿童中比较常见。通过数据的调查显示，绝大部分的病毒流行于在发展中的国家[1]。而在我国因人轮状病毒而引起的腹泻有40.0%，因此，这种病毒引起的腹泻所在的比重还是相当大。目前，临床上对于该病的治疗还无较好的药物，其中，人们认为轮状病毒疫苗是控制轮状病毒感染的一个重要举措。通过国内外的相关性研究[2，3，4]表明，不同的地区的病毒株均具有较大的不同，因此，这为临床中研制轮状病毒疫苗也具有较大的差异性。本文对南昌市的轮状病毒G型与其相关的临床特征进行深入的探讨，其目的是为本病的治疗与预防提高有力的参考资料，同时，为该地区研制具有针对性强的轮状病毒疫苗提高一定的参考依据。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1材料
本次研究从我院2007年1月到2009年12月之间进行随机的抽取5岁以下的腹泻患儿286例，同时对于其进行细菌培养和显微镜的检查，并有效的排除细菌性的肠炎患儿。本组男性患儿183例，女性患儿154例，患儿的年龄为3个月到60个月，平均年龄为(15.3±2.3)月。病程时间为2～13天，平均病程时间为(8.9±2.3)天，本组的所有患儿均未进行接种轮状病毒疫苗。
1.2方法
1.2.1DNA制备与检测
本次研究对于粪便RVRNA的提取和检测主要采用Trizol法，同时依据说明书进行操作，并提取粪便悬液中的核酸，然后采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行有效的检测[5]。本次研究中干燥标本采取pH=7.6的Tris液稀释1 mL/L进行稀释，并取上清液，同时，采取30μl的无菌水进行融解RNA备用。
, 百拇医药
1.2.2RT-PCR法扩增
将选取的RV的VP7全基因进行扩增，并采取 net-PCR法进行有效的对VP7基因型(G基因型)进行分型处理。第一次扩增：将编码VP7的基因两端保守的序列设计引物(主要包括Beg9和End9)进行RT-PCR扩增，长度为1062bp；第2次扩增：将苷酸序列高变区的设计型特异性引物(主要包括aAT8、aBT1和aCT2以及aDT4与aET3、aFT9等)和负链引物选择3′端保守的共同引物进行有效的扩增，扩增不同的长度来区别不同基因型[6]。本次研究所用的扩增引物如下表1所示：
1.2.3反应条件
本次研究选取的PCR反应池为2μL，取二甲基亚砜和上、下游的引物均2μL，并进行离心处理，离心率为1000 r/min，并取上层清液，然后采取温度为97℃进行变性，时间控制为5min，并立即进行冰浴处理，时间为5 min；向反应中加入5×RT-PCR的缓冲液和2. 5μL 的d NTP，以及5U/L的AMV反转录酶，并采取94℃的温度进行变性处理，时间为5min，最后加入10×PCR的缓冲液和DNA聚合酶以及dNTP，并加水到70μL。再次采取94℃的温度进行加热处理，时间控制为1min，并进行94℃、1min；42℃、2min；72℃、3 min；共30个循环，最后采取72℃的温度进行延伸，时间8min。并将扩增的产物采取10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳进行有效的观察。
, 百拇医药
2结果
通过本次的研究分析，286份标本共检出132份病毒，阳性率46.1%。通过分型，主要为G1型、G3型，具体的情况如下表2所示：
3讨论
通过资料显示，在我国主要流行轮状病毒为G1-G4型，而且在方肇寅等[7]人的资料显示，G1-G4型所占的比例为：67.1%、21.4%、9.4%、2.1%，其中， G1型是主要的流行菌株。而任莉娜等[8]分析，主要以G1型为主要的菌株。而徐锦等 [9]分析，主要以G3型菌株为主，其次才是G1型。而吴先华等报道[10]，在浙江省衢州市2008-2010年的资料显示，主要以G3型菌株为流行菌株。
通过本次的临床调查显示，在南昌地区主要以G3型菌株和G1型菌株为主，而且所在的比率分别为41.7%和27.3%，而且本次的研究与张丽杰等[11]的研究比较相近。另外，在我国的台湾等地区显示，除了显示有G1、G2以及G3型菌株之外，还显示有 G9型菌株 [12]。而在本次的研究分析， G9型轮状病毒只检测出有1株，而且资料显示G9型不是本地区的流行菌株另外，通过本次的研究分析，有19株病毒株未能够进行分型，其原因可能与本次研究的方法和G血清型等有关，需要临床的大型试验进一步的分析。
, 百拇医药
因此，在南昌地区的婴幼儿轮状病毒肠炎中，主要以G1型与G3型比较常见，同时，G1型和G3型能够作为该地区进行研制轮状病毒疫苗的重要参考依据。但是有仍部分的菌株未进行分型，需要进一步的临床监测。
参考文献
[1]van Doorn LJ，Kleter B，Hoefnagel E， etal .Detection and genotyping of human rotavirus VP4 and VP7 genes by reverse transcriptase PCR and reverse hybridization[J].Journal of Clinical Microbiology，2009，47(09)： 2704～2712., 百拇医药(陈富明)
【关键词】 轮状病毒腹泻；婴幼儿轮状病毒肠炎流行病学；分子 G血清型
人轮状病毒(HRV)是临床中比较常见的一种病毒，是诱发婴幼儿腹泻的一种重要病毒，而且多在5岁以下的儿童中比较常见。通过数据的调查显示，绝大部分的病毒流行于在发展中的国家[1]。而在我国因人轮状病毒而引起的腹泻有40.0%，因此，这种病毒引起的腹泻所在的比重还是相当大。目前，临床上对于该病的治疗还无较好的药物，其中，人们认为轮状病毒疫苗是控制轮状病毒感染的一个重要举措。通过国内外的相关性研究[2，3，4]表明，不同的地区的病毒株均具有较大的不同，因此，这为临床中研制轮状病毒疫苗也具有较大的差异性。本文对南昌市的轮状病毒G型与其相关的临床特征进行深入的探讨，其目的是为本病的治疗与预防提高有力的参考资料，同时，为该地区研制具有针对性强的轮状病毒疫苗提高一定的参考依据。
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1材料与方法
1.1材料
本次研究从我院2007年1月到2009年12月之间进行随机的抽取5岁以下的腹泻患儿286例，同时对于其进行细菌培养和显微镜的检查，并有效的排除细菌性的肠炎患儿。本组男性患儿183例，女性患儿154例，患儿的年龄为3个月到60个月，平均年龄为(15.3±2.3)月。病程时间为2～13天，平均病程时间为(8.9±2.3)天，本组的所有患儿均未进行接种轮状病毒疫苗。
1.2方法
1.2.1DNA制备与检测
本次研究对于粪便RVRNA的提取和检测主要采用Trizol法，同时依据说明书进行操作，并提取粪便悬液中的核酸，然后采取聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行有效的检测[5]。本次研究中干燥标本采取pH=7.6的Tris液稀释1 mL/L进行稀释，并取上清液，同时，采取30μl的无菌水进行融解RNA备用。
, 百拇医药
1.2.2RT-PCR法扩增
将选取的RV的VP7全基因进行扩增，并采取 net-PCR法进行有效的对VP7基因型(G基因型)进行分型处理。第一次扩增：将编码VP7的基因两端保守的序列设计引物(主要包括Beg9和End9)进行RT-PCR扩增，长度为1062bp；第2次扩增：将苷酸序列高变区的设计型特异性引物(主要包括aAT8、aBT1和aCT2以及aDT4与aET3、aFT9等)和负链引物选择3′端保守的共同引物进行有效的扩增，扩增不同的长度来区别不同基因型[6]。本次研究所用的扩增引物如下表1所示：
1.2.3反应条件
本次研究选取的PCR反应池为2μL，取二甲基亚砜和上、下游的引物均2μL，并进行离心处理，离心率为1000 r/min，并取上层清液，然后采取温度为97℃进行变性，时间控制为5min，并立即进行冰浴处理，时间为5 min；向反应中加入5×RT-PCR的缓冲液和2. 5μL 的d NTP，以及5U/L的AMV反转录酶，并采取94℃的温度进行变性处理，时间为5min，最后加入10×PCR的缓冲液和DNA聚合酶以及dNTP，并加水到70μL。再次采取94℃的温度进行加热处理，时间控制为1min，并进行94℃、1min；42℃、2min；72℃、3 min；共30个循环，最后采取72℃的温度进行延伸，时间8min。并将扩增的产物采取10 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳进行有效的观察。
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2结果
通过本次的研究分析，286份标本共检出132份病毒，阳性率46.1%。通过分型，主要为G1型、G3型，具体的情况如下表2所示：
3讨论
通过资料显示，在我国主要流行轮状病毒为G1-G4型，而且在方肇寅等[7]人的资料显示，G1-G4型所占的比例为：67.1%、21.4%、9.4%、2.1%，其中， G1型是主要的流行菌株。而任莉娜等[8]分析，主要以G1型为主要的菌株。而徐锦等 [9]分析，主要以G3型菌株为主，其次才是G1型。而吴先华等报道[10]，在浙江省衢州市2008-2010年的资料显示，主要以G3型菌株为流行菌株。
通过本次的临床调查显示，在南昌地区主要以G3型菌株和G1型菌株为主，而且所在的比率分别为41.7%和27.3%，而且本次的研究与张丽杰等[11]的研究比较相近。另外，在我国的台湾等地区显示，除了显示有G1、G2以及G3型菌株之外，还显示有 G9型菌株 [12]。而在本次的研究分析， G9型轮状病毒只检测出有1株，而且资料显示G9型不是本地区的流行菌株另外，通过本次的研究分析，有19株病毒株未能够进行分型，其原因可能与本次研究的方法和G血清型等有关，需要临床的大型试验进一步的分析。
, 百拇医药
因此，在南昌地区的婴幼儿轮状病毒肠炎中，主要以G1型与G3型比较常见，同时，G1型和G3型能够作为该地区进行研制轮状病毒疫苗的重要参考依据。但是有仍部分的菌株未进行分型，需要进一步的临床监测。
参考文献
[1]van Doorn LJ，Kleter B，Hoefnagel E， etal .Detection and genotyping of human rotavirus VP4 and VP7 genes by reverse transcriptase PCR and reverse hybridization[J].Journal of Clinical Microbiology，2009，47(09)： 2704～2712., 百拇医药(陈富明)
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