流式细胞仪检测技术与质量控制
【摘要】流式细胞术(FCM)检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。
【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制
流式细胞仪检验技术(FCM)，即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法
1.1 标本收集
收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针(SSO)固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针(SSO)在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价 该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面(如传染病指标等)的检测和研究。
4 讨论
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制(1Qc)和室间质量控制(EQA)顺利达标。
标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存时，EDTA抗凝的标本在室温下可保存12～24小时，肝素抗凝通常在室温下可保存至48～72小时，枸橼酸抗凝在室温下可保存至72小时，对于只作胞内染色的样本，根据待分析细胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定细胞后保存数周。
流式细胞仪的校准通常包括液路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性等[2]。仪器校准品主要成分为聚苯乙烯，它被制成各种大小或同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式细胞仪质控中的一种常用的标准品。
精密度及其校准微球精密度是通过对标准荧光微球检测其散射光和荧光的分布范围来描述的，通常以变异系数CV%来说明，CV%小于5可以满足大多数实验的要求。但细胞周期和倍体分析对仪器的精密度要求很高的，均质性细胞间的变异必须小于2%。灵敏度及其校准微球流式细胞仪的灵敏度可有多种表达方式，目前使用最为广泛的方式是可溶性荧光染料等价分子数(MESF)法。该方法所用试剂盒由一系列标记有MESF值的微球组成(包括未标记荧光的空白微球)，表明该微球所标记荧光物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数，根据微球检测结果的平均荧光强度进行线性回归分析，可得到流式细胞仪灵敏度的回归曲线，回归曲线与Y轴的交点即为该机的灵敏度，或叫做最低检测限度[3]。准确度及其校准流式细胞仪的准确度同精密度和灵敏度相比不很重要，但随着定量流式细胞技术的发展和荧光定量分析在实际工作中的需求越来越大，流式细胞仪准确度的评价和质控品也开始受到重视，在样品中加入内标或某些生物活细胞，如鸡或鱼的红细胞，可对仪器准确度进行有效监测。当使用两种或以上的荧光素进行分析时，激光激发下的相邻或相近荧光素发出的荧光会产生交叉重叠，从而干扰检测结果，通过调整荧光补偿，可以保证每个检测器检测到恰当的单一荧光信号，即保证了结果的可靠性。荧光补偿是流式细胞术多色分析前必须进行的仪器校准，通常采用每种荧光素或相应的标记抗体对抗原表达量适中的细胞进行单染色，来进行仪器补偿调整，也可以通过商品化荧光补偿试剂进行。当使用各种标准微球对仪器进行校正时，需要将微球测定结果绘制成质控图，Levey-Jennings质控图是目前在临床检验质量控制中使用较多的方法，根据Levey-Jennings质控图的评价要点来观察质控结果是否超过控制限以决定失控与否。室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度，自2000年以来，我国由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评工作，现已开展的项目包括T细胞亚群分析和CD34绝对计数。
【参考文献】
[1] 崔巍，牛福玲，何丽云，王硕仁.流式细胞术检测细胞凋亡的分析软件比较.北京中医药大学学报.2001.(6)45-47
[2] 陶德定；冷彦；覃吉超；余源；龚建平.新鲜肿瘤标本活细胞与固定细胞的DNA含量分析比较.癌症：英文版.200120(5)：502-504
[3] 曾文军，王柳均，樊翌明，吴志华.细胞凋亡的流式细胞仪检测技术研究进展[J].医学文选.2005.24(3)：425-426, 百拇医药(刘敏 周晓明 张颖)
【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制
流式细胞仪检验技术(FCM)，即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法
1.1 标本收集
收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。
2 检测方法
2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针(SSO)固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。
2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针(SSO)在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。
3 方法学评价 该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在96孔微板上可进行大规模的检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用免疫磁珠作为载体，具有快速、简便、可靠的优点，平均每个孔在流式细胞仪上检测的时间不到30s。目前已有商品化的试剂供应，同时该技术也广泛应用于其他方面(如传染病指标等)的检测和研究。
4 讨论
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制(1Qc)和室间质量控制(EQA)顺利达标。
标本采集和制备，用于流式细胞分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液及组织等，每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。原则上标本应在采集后立刻进行处理和荧光染色，尤其对检测细胞活性的标本，需要在采集后1小时内染色测定。在某些特殊情况下不能及时进行标本制备和检测而需要保存时，EDTA抗凝的标本在室温下可保存12～24小时，肝素抗凝通常在室温下可保存至48～72小时，枸橼酸抗凝在室温下可保存至72小时，对于只作胞内染色的样本，根据待分析细胞的抗原特性和染色方式，可采用70%冷乙醇或1%多聚甲醛等固定细胞后保存数周。
流式细胞仪的校准通常包括液路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性等[2]。仪器校准品主要成分为聚苯乙烯，它被制成各种大小或同时拥有定量免疫球蛋白结合位点的荧光微球，这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式细胞仪质控中的一种常用的标准品。
精密度及其校准微球精密度是通过对标准荧光微球检测其散射光和荧光的分布范围来描述的，通常以变异系数CV%来说明，CV%小于5可以满足大多数实验的要求。但细胞周期和倍体分析对仪器的精密度要求很高的，均质性细胞间的变异必须小于2%。灵敏度及其校准微球流式细胞仪的灵敏度可有多种表达方式，目前使用最为广泛的方式是可溶性荧光染料等价分子数(MESF)法。该方法所用试剂盒由一系列标记有MESF值的微球组成(包括未标记荧光的空白微球)，表明该微球所标记荧光物质的荧光强度等同于溶液中荧光染料的分子数，根据微球检测结果的平均荧光强度进行线性回归分析，可得到流式细胞仪灵敏度的回归曲线，回归曲线与Y轴的交点即为该机的灵敏度，或叫做最低检测限度[3]。准确度及其校准流式细胞仪的准确度同精密度和灵敏度相比不很重要，但随着定量流式细胞技术的发展和荧光定量分析在实际工作中的需求越来越大，流式细胞仪准确度的评价和质控品也开始受到重视，在样品中加入内标或某些生物活细胞，如鸡或鱼的红细胞，可对仪器准确度进行有效监测。当使用两种或以上的荧光素进行分析时，激光激发下的相邻或相近荧光素发出的荧光会产生交叉重叠，从而干扰检测结果，通过调整荧光补偿，可以保证每个检测器检测到恰当的单一荧光信号，即保证了结果的可靠性。荧光补偿是流式细胞术多色分析前必须进行的仪器校准，通常采用每种荧光素或相应的标记抗体对抗原表达量适中的细胞进行单染色，来进行仪器补偿调整，也可以通过商品化荧光补偿试剂进行。当使用各种标准微球对仪器进行校正时，需要将微球测定结果绘制成质控图，Levey-Jennings质控图是目前在临床检验质量控制中使用较多的方法，根据Levey-Jennings质控图的评价要点来观察质控结果是否超过控制限以决定失控与否。室间质量评价主要是控制实验室工作的不准确度，自2000年以来，我国由卫生部临床检验中心开始组织开展临床流式细胞术室间质评工作，现已开展的项目包括T细胞亚群分析和CD34绝对计数。
【参考文献】
[1] 崔巍，牛福玲，何丽云，王硕仁.流式细胞术检测细胞凋亡的分析软件比较.北京中医药大学学报.2001.(6)45-47
[2] 陶德定；冷彦；覃吉超；余源；龚建平.新鲜肿瘤标本活细胞与固定细胞的DNA含量分析比较.癌症：英文版.200120(5)：502-504
[3] 曾文军，王柳均，樊翌明，吴志华.细胞凋亡的流式细胞仪检测技术研究进展[J].医学文选.2005.24(3)：425-426, 百拇医药(刘敏 周晓明 张颖)