成熟中国鲎黄色结缔组织中氨基酸含量分析
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摘要：目的测定成熟中国鲎黄色结缔组织中氨基酸的含量。方法用反相液相色谱法。结果鲎黄色结缔组织中氨基酸总含量为79.04 mg/g；各种氨基酸中，含量较高的是谷氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和甘氨酸，占总含量的63.26%，7种人体必需氨基酸的含量占总含量的43.55%。结论反相液相色谱法可用于测定鲎黄色结缔组织中氨基酸含量。
关键词：成熟中国鲎；黄色结缔组织；氨基酸
中图分类号：Q493.99文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)03-0041-03
Assay of Amino Acids of Yellow Connective Tissue in Mature Horseshoe Crab of China
WEI Jing-guang1, 2, DAI Jian-guo1*, JIN Gang1, HUO Guang-hua2
, 百拇医药
(1. Department of Biological Applied Engineering, Shenzhen Polytechnic College, Shenzhen 518055, China;2. Department of Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)
Abstract：Objective To determine the content of amino acids of yellow connective tissue in mature horseshoe crab of China. Methods RP-HPLC was used. Results The total content of amino acids of yellow connective tissue reached up to 79.04 mg/g. The amino acids with high contents were Glu, Ile, Asp, Leu and Gly, which occupied 63.26% of total content. There were 7 essential amino acids with 43.55%of total content. Conclusion The method of RP-HPLC is fit to determine the content of amino acids of yellow connective tissue in mature horseshoe crab of China.
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Key words：mature horseshoe crab of China; yellow connective tissue; amino acid
黄色结缔组织是鲎体内重要的组织结构，占机体重量的比例大，充满了外壳包被的整个机体，且填充于内脏器官之间。它在鲎的生理活动中起着极为重要的作用。鲎耐饥饿能力很强，春夏季节时，食物充分，可大量进食；秋冬季，鲎往深海迁移，摄食少，甚至长时间不进食。鲎的强耐饥饿能力可能与鲎体内发达的黄色结缔组织储存大量的营养物质有关[1, 2]。目前有关鲎的研究多集中在血液学方面，对其体内黄色结缔组织的研究报道较少。实验分析了成熟中国鲎黄色结缔组织的氨基酸含量，以期为进一步开发利用中国鲎提供实验依据。
1 材料与方法
1.1材料
黄色结缔组织取自成熟的中国鲎。
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1.2仪器
Agilent 1100 高效液相色谱仪，四元梯度泵，二极管阵列检测器(DAD)，自动进样器，HP-A.09.01 化学工作站(Agilent，美国)；酸度计(ORION，美国)。
1.3试剂
氨基酸的标准品和混合品，衍生剂邻苯二甲醛(OPA)(Agilent)；正缬氨酸(ISTD)，氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)(Sigma)；甲醇，乙腈(色谱纯，天津协和公司)；三乙醇胺，四氢呋喃，乙酸钠(分析纯，广州化学试剂厂)。
1.4方法
1.4.1样品前处理取成熟中国鲎的黄色结缔组织，匀浆，冻干，干燥保存，备用。
1.4.2试剂配制[3]流动相A：0.02 mol/L醋酸钠溶液1 000 mL，加三乙醇胺180 μL，用1%~2%醋酸调pH至7.20±0.05，加四氢呋喃3 mL，0.45 mm滤膜过滤后，超声处理10 min。
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流动相B：0.02 mol/L醋酸钠溶液(pH7.20±0.05)-乙腈-甲醇(1:2:2)，0.45μm滤膜过滤后，超声处理10 min。
内标溶液：称取58.6 mg正缬氨酸溶于50 mL 0.1 mol/L HCl溶液中，配成10 nmol·μL贮备液，保存于0~4 ℃，使用时用0.1 mol/L 盐酸稀释至1 nmol/μL。
衍生剂邻苯二甲醛(OPA)：Agilent试剂盒，浓度为10 mg/mL；衍生剂FMOC-Cl：称取12.5 mg 溶于5 mL 乙腈中，保存于0 ~4 ℃，备用。
标准氨基酸溶液的配制：将17种混合氨基酸标准品(浓度1 nmol·μL)，用0.1 mol/L 盐酸依次稀释成500，250，100，25 pmol·μL5个浓度，保存于0～4℃，备用。
1.4.3标准氨基酸取样用自动进样器依次吸取6.0 μL的0.4 mol/L的硼酸缓冲液(pH 9.5)，1.0 μL OPA，1.0 μL的混合氨基酸，1.0 μL内标溶液，1.0 μL FMOC-Cl，自动混匀后，衍生即得。
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1.4.4样品处理与衍生化称取100 mg样品置安瓿中，加6 mol/L盐酸5 mL，抽真空立即熔封，置入烘箱，在110 ℃下水解24 h，冷却后打开安瓿，转移至小烧杯中，水浴挥干盐酸，再用水洗涤数次，彻底挥干盐酸，用0.1 mol/L盐酸溶解，并定容至25 mL，用0.45 μm 滤膜滤过，滤液备用。用自动进样器依次吸取6.0μL 0.4 mol/L的硼酸缓冲液(pH 9.5)，1.0μL OPA，1.0μL样品，1.0μL内标液，1.0 μL FMOC-Cl，自动混匀后，衍生即得。
1.4.5色谱分析条件色谱柱 Hypersil ODS C18 柱(200 mm×4.6 mm，5μm)，柱温：35 ℃；DAD可变波长检测程序和流动相梯度洗脱程序见表1，表2。
表 1DAD可变波长检测程序
表 2流动相梯度洗脱程
, http://www.100md.com 2 结果与分析
2.1标准氨基酸和黄色结缔组织中氨基酸图谱
2.2氨基酸含量测定结果
利用反相液相色谱法测定了中国鲎黄色结缔组织中17种氨基酸，结果见表3。
表 3中国鲎组织中氨基酸含量测定结果
“-”为含量过低未能统计
由表4可见，鲎的黄色结缔组织中氨基酸含量高达79.04 mg/g。测得的各种氨基酸中，含量较高的是Glu、Ile、Asp、Leu和Gly，其含量之和占总氨基酸含量的63.26%；Glu不但是鲜味氨基酸，而且是脑营养剂，是人类消耗最大的一种氨基酸，能促进神经细胞兴奋，对大脑功能和中枢神经系统的正常活动具有重要意义，可用于治疗小儿神经发育滞后、神经衰弱和提高智力等[4]；Ile是人体的必需氨基酸之一，由于人体不能自身合成，完全依靠食物供给。17种氨基酸中的人体必需氨基酸有7种(色氨酸水解过程中被破坏，未检测到)，其含量之和占总含量的43.55%，充分说明中国鲎是一种营养价值丰富的海洋节肢动物。
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图 1 18种氨基酸混合标准溶液的HPLC图谱
图 2 成熟中国鲎黄色结缔组织HPLC图谱
3讨论
鲎的黄色结缔组织是非常发达的结构，其主要构成细胞——营养细胞储存着丰富的营养颗粒，黄色结缔组织占机体比重很大，是鲎体内巨大的营养库，鲎其它组织的分化、内脏器官的生理活动都与其密切相关。本实验利用反相液相色谱法分析了其氨基酸的含量，结果表明，用OPA和FMOC-Cl联合柱前衍生，衍生反应时间2 min，可同时测得17种氨基酸，是一种理想的全谱氨基酸分析方法。
参考文献
[1]翁朝红，谢仰杰，洪水根. 中国鲎黄色结缔组织的研究Ⅰ.黄色结缔组织显微结构观察[J]. 集美大学学报(自然科学版)，2001，6(4)：301-307.
[2]翁朝红，洪水根. 鲎的分布及生活习性[J]. 动物学杂志，2001，36(5)：428.
[3]许柏球，杨剑. 反相高效液相色谱法测定荔枝果实游离氨基酸[J]. 食品科学. 2004，25(12)：156-159.
[4]黄勇其，陈龙珠. 贵州五种南参药材中氨基酸含量的比较[J]. 中国药业，2002，11(4)：62., 百拇医药(魏京广 代建国 金 刚 霍光华)