非病毒基因载体在肺癌基因治疗中的应用
摘要：对近年采用非病毒载体(裸DNA、阳离子聚合物、阳离子脂质体)治疗肺癌的基本原理和研究进展作一综述。此法有望成为治疗肺癌的新方案。
关键词：肺癌；基因治疗；非病毒载体
中图分类号：R734.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)05-0042-04
Application of Nonviral Gene Vectors in Gene Therapy of Lung Cancer
YE Jie-sheng, ZHANG Na, ZOU Wei-wei, Wang Ju-tao
(School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China)
, 百拇医药
Abstract：This paper briefly reviews the general principles and development of gene delivery with emphasis on the recent developments in the arena of lung cancer using nonviral (naked DNA, polycationic polymers, cationic liposomes) vectors. Employing gene transfer techniques to achieve therapeutically useful levels of expression of therapeutic gene in the lung could provide a new strategy for the treatment of lung cancer.
Key words：lung cancer; gene therapy; nonviral vectors
, 百拇医药
尽管肺癌的诊断和治疗取得了进展，但近5年来癌症的存活率只有14%，仅略高于20世纪60年代早期的8% [1]，多数晚期肺癌患者最终只能选择放弃治疗。现行肺癌治疗方案存在的主要问题是缺乏肿瘤特异性而产生毒副作用，因此，基因疗法作为未来癌症治疗策略引起了越来越多的关注。基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择。基因传递载体可分为2类：病毒载体(逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等)和非病毒载体(裸DNA、聚阳离子聚合物、阳离子脂质体等)。采用病毒型基因载体虽取得了一定的成效，但有缺陷，包括基因突变、致癌作用以及免疫反应使基因表达过于短暂等。此外，病毒载体还受插入病毒基因组外源基因大小的限制。而非病毒基因传递系统凭借其低毒性、低免疫原性和较易制备等优点有望成为体内基因治疗的理想载体。基因载体技术的快速发展使非病毒基因治疗手段更加适用于死亡率高的疾病如肺癌等。现对目前用于介导肺癌基因治疗的主要非病毒基因载体作一介绍。
1裸DNA
非病毒基因传递系统研究中最简单的方法就是直接使用裸露的质粒DNA进行基因转染。自从Wolff等最先证明骨骼肌可被DNA转染以来，裸质粒DNA注射介导外源基因转移和表达已被广泛应用。质粒具有制备简便、廉价且安全性较高等优点，然而，质粒转染率通常较低且基因表达短暂。实验证明，采用快速注射和电穿孔技术对肺癌施行基因治疗能够提高药物的药效，从而在一定程度上弥补直接使用裸DNA转染的不足。
, http://www.100md.com
1.1快速注射技术
快速注射技术是近年在基因治疗领域应用相对广泛的一种无针注射技术。Walther 等[2]在患有路易士肺癌的小鼠肿瘤部0.30 Mpa压力下快速注射3~5 mg质粒DNA，结果显示，注射48 h后 LacZ 或GFP中度表达，72，96 h后上述高度表达。同时注射TNF-α和载体携带的LacZ，在注射24，48，72，96和120 h后肿瘤组织中均能有效的表达和分泌细胞因子与LacZ。
1.2电穿孔技术
20世纪60年代提出的电穿孔术是一项通过控制电场强度使细胞通透性增加的技术，1988年首次用于将基因导入肺上皮细胞。为了提高非病毒载体在肺部基因转染的水平，Dean等[3]将电穿孔术用于肺部，结果表明，电穿孔术能将裸DNA导入肺中，安全有效并为以后的肺靶向基因治疗奠定了基础。有报道，采用基因枪[4]或结合核酸酶抑制剂[5] 治疗肺癌也能够获得较高的基因表达。
, http://www.100md.com
2阳离子聚合物
采用裸质粒DNA作为基因转移载体的方法尽管简便易行，但也有缺陷，例如穿透细胞能力弱，很难有效地转入细胞核，能被质粒转导的肿瘤细胞数量和比例小。因此，它极易被组织清除，难以全身转运。为了提高基因转染率，许多可用于体内实验的新型阳离子聚合物载体相继问世，常见的有聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸和壳聚糖。
2.1聚乙烯亚胺
聚乙烯亚胺(PEI)是首个用于组织培养和体内试验的阳离子聚合物。PEI最显著的特点是携带较高的正电荷密度。PEI的每3个原子中就有1个能质子化的氮原子，从而使PEI中的正电荷密度达到20~25 μeq/g [6]。Abdallah等指出，PEI的体内转染率受到相对分子质量的影响，还发现，相对分子质量为25 000的PEI的转染率比相对分子质量大的高。PEI在体内能有效地将DNA运送至肿瘤组织，尽管有报道，PEI能够有效地通过静脉注射[7]，瘤内注射[8]或者微泵给药用于癌症的体内治疗，然而，通过吸入给药的基因传递可能更适用于肺部疾病的治疗，因为它能到达更大的表面积并且避免其它系统给药方式的风险[9]。
, 百拇医药
有学者用含有鼠IL-12基因的PEI气雾剂(PEI/IL-12，600 μL PEI 和2 mg IL-12)连续2周治疗骨肉瘤肺部转移的小鼠，每周给药2次，结果显示，IL-12中的p35 和p40亚基在小鼠肺部高度表达而肝脏不表达。此气雾剂单剂量给药24 h后IL-12 的mRNA表达最高，持续监测7 d该表达逐渐减弱。用气雾剂治疗6周后，血浆中未检测到IL-12蛋白质，接受气雾剂治疗的小鼠肺部肿瘤数量显著减少[10]。因病毒载体含有能靶向于细胞核受体的特异蛋白质，因此，很多来源于病毒蛋白质的多肽用于增强质粒的转运。同样，为了提高基于PEI处方的转染率和靶向效率，PEI也常连接特定的病毒蛋白质。研究表明，与HIV-1 TAT蛋白转导区相关的寡肽能够通过共价键与PEI和PEG结合形成TAT-PEG-PEI结合物。有学者研究了结合DNA的PEI和TAT-PEG-PEI聚合物在体外(A549细胞)和小鼠气管滴注给药的转染率。结果显示，在A549细胞中使用TAT-PEG-PEI(0.2 ng/mg蛋白质)时荧光素酶的表达比使用PEI(2 ng/mg)时低，但在小鼠体内采用TAT-PEG-PEI的转染率明显高于PEI[11]。此外，PEI与某些配基(如单糖)接合后能够增强对特定细胞的靶向性。Kim等[9]研究发现，将含有葡萄糖基化的PEI，重组质粒 pcDNA3.0-磷酸酶和除去张力蛋白的10号染色体(PTEN)的复合物通过鼻吸入方式为肺癌模型小鼠给药，结果表明小鼠肺部的PTEN蛋白高度表达。, http://www.100md.com(叶杰胜 张 娜 邹伟伟 王举涛)
关键词：肺癌；基因治疗；非病毒载体
中图分类号：R734.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)05-0042-04
Application of Nonviral Gene Vectors in Gene Therapy of Lung Cancer
YE Jie-sheng, ZHANG Na, ZOU Wei-wei, Wang Ju-tao
(School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China)
, 百拇医药
Abstract：This paper briefly reviews the general principles and development of gene delivery with emphasis on the recent developments in the arena of lung cancer using nonviral (naked DNA, polycationic polymers, cationic liposomes) vectors. Employing gene transfer techniques to achieve therapeutically useful levels of expression of therapeutic gene in the lung could provide a new strategy for the treatment of lung cancer.
Key words：lung cancer; gene therapy; nonviral vectors
, 百拇医药
尽管肺癌的诊断和治疗取得了进展，但近5年来癌症的存活率只有14%，仅略高于20世纪60年代早期的8% [1]，多数晚期肺癌患者最终只能选择放弃治疗。现行肺癌治疗方案存在的主要问题是缺乏肿瘤特异性而产生毒副作用，因此，基因疗法作为未来癌症治疗策略引起了越来越多的关注。基因治疗的关键技术是基因传递载体的选择。基因传递载体可分为2类：病毒载体(逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等)和非病毒载体(裸DNA、聚阳离子聚合物、阳离子脂质体等)。采用病毒型基因载体虽取得了一定的成效，但有缺陷，包括基因突变、致癌作用以及免疫反应使基因表达过于短暂等。此外，病毒载体还受插入病毒基因组外源基因大小的限制。而非病毒基因传递系统凭借其低毒性、低免疫原性和较易制备等优点有望成为体内基因治疗的理想载体。基因载体技术的快速发展使非病毒基因治疗手段更加适用于死亡率高的疾病如肺癌等。现对目前用于介导肺癌基因治疗的主要非病毒基因载体作一介绍。
1裸DNA
非病毒基因传递系统研究中最简单的方法就是直接使用裸露的质粒DNA进行基因转染。自从Wolff等最先证明骨骼肌可被DNA转染以来，裸质粒DNA注射介导外源基因转移和表达已被广泛应用。质粒具有制备简便、廉价且安全性较高等优点，然而，质粒转染率通常较低且基因表达短暂。实验证明，采用快速注射和电穿孔技术对肺癌施行基因治疗能够提高药物的药效，从而在一定程度上弥补直接使用裸DNA转染的不足。
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1.1快速注射技术
快速注射技术是近年在基因治疗领域应用相对广泛的一种无针注射技术。Walther 等[2]在患有路易士肺癌的小鼠肿瘤部0.30 Mpa压力下快速注射3~5 mg质粒DNA，结果显示，注射48 h后 LacZ 或GFP中度表达，72，96 h后上述高度表达。同时注射TNF-α和载体携带的LacZ，在注射24，48，72，96和120 h后肿瘤组织中均能有效的表达和分泌细胞因子与LacZ。
1.2电穿孔技术
20世纪60年代提出的电穿孔术是一项通过控制电场强度使细胞通透性增加的技术，1988年首次用于将基因导入肺上皮细胞。为了提高非病毒载体在肺部基因转染的水平，Dean等[3]将电穿孔术用于肺部，结果表明，电穿孔术能将裸DNA导入肺中，安全有效并为以后的肺靶向基因治疗奠定了基础。有报道，采用基因枪[4]或结合核酸酶抑制剂[5] 治疗肺癌也能够获得较高的基因表达。
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2阳离子聚合物
采用裸质粒DNA作为基因转移载体的方法尽管简便易行，但也有缺陷，例如穿透细胞能力弱，很难有效地转入细胞核，能被质粒转导的肿瘤细胞数量和比例小。因此，它极易被组织清除，难以全身转运。为了提高基因转染率，许多可用于体内实验的新型阳离子聚合物载体相继问世，常见的有聚乙烯亚胺、多聚赖氨酸和壳聚糖。
2.1聚乙烯亚胺
聚乙烯亚胺(PEI)是首个用于组织培养和体内试验的阳离子聚合物。PEI最显著的特点是携带较高的正电荷密度。PEI的每3个原子中就有1个能质子化的氮原子，从而使PEI中的正电荷密度达到20~25 μeq/g [6]。Abdallah等指出，PEI的体内转染率受到相对分子质量的影响，还发现，相对分子质量为25 000的PEI的转染率比相对分子质量大的高。PEI在体内能有效地将DNA运送至肿瘤组织，尽管有报道，PEI能够有效地通过静脉注射[7]，瘤内注射[8]或者微泵给药用于癌症的体内治疗，然而，通过吸入给药的基因传递可能更适用于肺部疾病的治疗，因为它能到达更大的表面积并且避免其它系统给药方式的风险[9]。
, 百拇医药
有学者用含有鼠IL-12基因的PEI气雾剂(PEI/IL-12，600 μL PEI 和2 mg IL-12)连续2周治疗骨肉瘤肺部转移的小鼠，每周给药2次，结果显示，IL-12中的p35 和p40亚基在小鼠肺部高度表达而肝脏不表达。此气雾剂单剂量给药24 h后IL-12 的mRNA表达最高，持续监测7 d该表达逐渐减弱。用气雾剂治疗6周后，血浆中未检测到IL-12蛋白质，接受气雾剂治疗的小鼠肺部肿瘤数量显著减少[10]。因病毒载体含有能靶向于细胞核受体的特异蛋白质，因此，很多来源于病毒蛋白质的多肽用于增强质粒的转运。同样，为了提高基于PEI处方的转染率和靶向效率，PEI也常连接特定的病毒蛋白质。研究表明，与HIV-1 TAT蛋白转导区相关的寡肽能够通过共价键与PEI和PEG结合形成TAT-PEG-PEI结合物。有学者研究了结合DNA的PEI和TAT-PEG-PEI聚合物在体外(A549细胞)和小鼠气管滴注给药的转染率。结果显示，在A549细胞中使用TAT-PEG-PEI(0.2 ng/mg蛋白质)时荧光素酶的表达比使用PEI(2 ng/mg)时低，但在小鼠体内采用TAT-PEG-PEI的转染率明显高于PEI[11]。此外，PEI与某些配基(如单糖)接合后能够增强对特定细胞的靶向性。Kim等[9]研究发现，将含有葡萄糖基化的PEI，重组质粒 pcDNA3.0-磷酸酶和除去张力蛋白的10号染色体(PTEN)的复合物通过鼻吸入方式为肺癌模型小鼠给药，结果表明小鼠肺部的PTEN蛋白高度表达。, http://www.100md.com(叶杰胜 张 娜 邹伟伟 王举涛)