啤酒腐败菌分子检测技术的研究进展
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摘要：对啤酒腐败菌检测中分子检测技术应用的研究进展作一综述。内容包括聚合酶链式反应，限制性片段长度多态性，免疫学技术，核酸杂交，伏安型生物传感器。
关键词：啤酒腐败菌；聚合酶链式反应；限制性片段长度多态性；免疫学技术；核酸杂交；伏安型生物传感器
中图分类号：R155.5文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)06-0055-03
Progress on Molecular Bio-techniques Used for Detection of Beer-spoilage Microorganisms
ZHANG Quan-bin, LI Yan-qin
(Institute of Biotechnology of Shanxi University, Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Taiyuan, 030006, China)
Abstract ：The research advance on the detection methods of beer-spoilage microorganisms is reviewed, including polymerase chain reaction, restriction fragment length polymorphism, immunity technology, nucleic acid hybridization and, voltammetric biosensor.
Key words ：beer-spoilage microorganisms; polymerase chain reaction; restriction fragment length polymorphism; immunity technology; nucleic acid hybridization; voltammetric biosensor
在啤酒生产和储存过程中，腐败菌污染可引起啤酒混浊和沉淀，甚者影响口感。啤酒生产中常见的腐败菌包括乳酸菌如：Lactobacillus brevis，Lactobacillus lindneri 和Pediococcus damnosus，以及一些革兰阴性菌如Pectinatus cerevisiphilus，Pectinatus frisingensis和Megasphaera cerevisiae，还有一些野生的非培养酵母如S. cerevisiae var diastaticus和S. cerevisiae var pastoriames[1]。这些腐败菌给啤酒业造成了巨大损失。为了保证啤酒质量，生产生活中需要一种快速灵敏的在线检测啤酒腐败菌的方法。检测啤酒腐败菌的传统方法，如镜检、平板培养、产气实验、生化反应等都不同程度地存在试验周期长、灵敏度低、不能确定污染菌种类等缺点。当检测结果出来时，产品被污染的程度已不能挽回。随着分子生物学技术的发展，科研工作者现致力于将分子诊断技术用于啤酒腐败菌的检测，其最大优点是快速、灵敏，不需培养，可在线检测。此技术也适用于其他食品及发酵过程污染菌的检测。现对啤酒发酵过程中腐败菌分子检测技术的研究进展作一综述。
1聚合酶链式反应(PCR)技术用于检测啤酒腐败菌
1.1使用一对特异引物的PCR
生产啤酒的原料之一酒花对绝大部分微生物的生长有抑制作用。有些乳杆菌能在啤酒中生长是因为含有似horA基因，此基因产物使这些菌对酒花中的异α-酸产生抗性。东京大学的科研人员根据horA的部分基因序列设计了特异引物，用PCR检测似horA基因来确定是否被乳杆菌污染[2]。horA-PCR技术检测乳杆菌只需6 h左右，用培养技术则需2～7 d，大大缩短了检测时间。田小群等[3]从Genbank中下载了10个属63种啤酒腐败菌和8个属13种常见非腐败菌的16 S rDNA序列，用DNAstar软件进行序列比对分析，设计出一对适合所有腐败菌的通用引物，使用这对引物检测从啤酒厂分离的8种腐败菌，结果均为阳性，对13种非腐败菌的检测则为阴性。郑飞云等[4]分析了啤酒酿造中的主要污染菌棗乳酸杆菌34个种的16 S rDNA基因序列，发现乳酸杆菌16 S rDNA之间具有很高的同源性，并且有一段明显的高变区，从而在保守区设计了乳酸杆菌的通用引物，在高变区可选择针对各种乳酸杆菌的特异引物。他们根据高变区两边的保守序列设计了一对乳酸杆菌特征引物，此引物能准确、灵敏的扩增出乳酸杆菌16 S rDNA，而不会扩增其它细菌的基因片段。
1.2随机扩增多态DNA-PCR(RAPD-PCR)
RAPD-PCR用随机排列的寡核苷酸单链(通常为10个核苷酸)为引物，对基因组DNA进行PCR扩增。对每个微生物种或某一特定的混合群体，每一引物仅能产生唯一的指纹图谱，将被检测样品图谱与标准图谱对照即可知道是否污染了杂菌。RAPD-PCR具有快速、简便和不需预先知道模板序列等优点。本实验室从76条随机引物中经过多次实验，筛选出4条适于检测啤酒发酵过程中腐败菌的引物，其PCR产物的图谱清晰、稳定、条带数量适中、主带明显，并能区别不同的酵母及污染细菌，其灵敏度可达0.1 %[5] ......
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