重组人锰超氧化物歧化酶纯化条件研究
摘要：目的研究重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的纯化条件。方法超声法破碎细胞，用热变性方法沉淀蛋白质；优化DEAE离子交换层析的的分离条件，并用葡聚糖凝胶G100分子筛分离纯化蛋白质。结果菌体破碎最佳超声功率为300W，超声70个循环，粗酶液热处理最佳温度为75 ℃，时间10 min；DEAE上样缓冲液最佳pH值为9.0，洗脱液NaCl含量为0.1 mol/L ， G100纯化后，rhMn-SOD比活达到4 411.706 U/mg，纯化倍数是粗酶液的5倍。结论得到了适于分离纯化rhMn-SOD的较简便的工艺。
关键词：重组人锰超氧化物歧化酶；大肠杆菌；离子交换层析
中图分类号：Q554文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)07-0001-05
Study on Purification Condition of Recombinant Human Manganese Superoxide Dismutase
, http://www.100md.com
CHENG Yi1,CHEN Che-sheng2, WU Qian-yi2, ZHAO Jian1*,YUAN Qin-sheng1
(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science & Technology, Shanghai 200237, China; 2. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
Abstract：Objective To study the purification method of recombinant human manganese superoxide dismutase(rhMn-SOD). Methods The cells were fragmented by ultrasonic. The protein was precipitated by the thermal denaturation. The condition of proteins separation by DEAE ion exchange chromatography was optimized, then Sephadex G-100 molecular sieving was used to purify protein. Results The optimization condition of ultrasonic power was 300 W, the cycles of ultrasonic were 70 cycles, the best thermal denaturation was 75 ℃and time was 10 minutes. The optimal pH value of loading buffer solution of DEAE was 9.0, the elution buffer was 0.1mol/LNaCl. After G-100, the specific activity of rhMn-SOD wa℃s 4 411.706 U/mg and it was 5-fold higher than crude enzyme extract. Conclusion The convenient method of separation and purification of rhMn-SOD is obtained.
, 百拇医药
Key words：recombinant human manganese superoxide dismutase; Escherichia coli; ion exchange chromatography
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一类广泛存在于生物界的金属酶类[1]，是生物体防御活性氧(ROS)毒害的关键性防线，能催化超氧阴离子(O2.-)发生歧化反应，从而清除O2.-。具有抗衰老、防辐射及治疗炎症等一系列功能，已被广泛应用于食品及医疗保健行业[2]。真核细胞内的SOD主要有Cu，Zn，SOD和Mn-SOD 等。Mn-SOD存在于线粒体中，近年研究发现，Mn-SOD与炎症、衰老及肿瘤等多种疾病有关[3，4]。传统的Mn-SOD纯化方法较繁琐且费时费力，不利于规模化生产[5]。本课题组前期已经构建表达质粒pET-Mn-SOD并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌[6]，在摇瓶中进行了IPTG诱导表达条件的研究[7]及不同诱导剂的比较研究[8]，系统研究了乳糖诱导高效表达Mn-SOD的发酵培养条件。本实验在此基础上，利用rhMn-SOD对热稳定的性质，用热变性法替代传统的硫酸铵分级沉淀蛋白质，并通过DEAE离子交换层析和葡聚糖凝胶G100分子筛进一步纯化分离，探讨了重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的纯化条件，建立了简便快捷且有利于规模化生产rhMn-SOD的方法。
, http://www.100md.com
1材料与方法
1.1菌株
含rhMn-SOD表达质粒的基因工程菌株，由本室施惠娟等构建并保存。
1.2试剂
DEAE-Sepharose Fast Flow(法玛西亚公司)；葡聚糖凝胶G-100(Whatman公司)；牛血清白蛋白，硫酸卡那霉素(上海源聚生物科技有限公司)；连苯三酚(E. Merk)；丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺(Fluka公司)；考马斯亮蓝G250，R250(Fluka公司)；其余为国产分析纯试剂。
1.3仪器
Model J2-21M型高速冷冻离心机(Beckman公司)；JY 92-Ⅱ超声波细粉破碎机(宁波新芝科器研究所)；HYG-Ⅱ回转式恒温调速摇瓶培养柜(上海新蕊自动化设备有限公司)；JM-250电泳仪(大连捷迈科建有限公司)； UV-2100紫外分光光度计(UNICO)。
, 百拇医药
1.4方法
1.4.1粗酶液的制备接种可表达rhMn-SOD的基因工程菌E.coli BL21(DE3)(含有pET24a(+)质粒)单菌落于含50μg/mL 卡那霉素的LB培养液，37 ℃振荡培养12 h后，按1%接种量将活化菌转移入LB培养基中(含50μg/mL 卡那霉素)，37 ℃，200 r/min摇床培养12 h，作为种子液。以5%的接种量接入种子液，37 ℃，200 r/min摇床进行二级培养。至A600约为2.2时用终浓度为0.25%的乳糖和2 mmol/L MnCl2诱导表达，诱导后6 h终止培养。离心收集菌体，称重。按1:10的比例将菌体悬浮于pH 9.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，冰浴中用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声功率为300 W，每次工作5 s，间隔5 s，循环70次。超声液在4 ℃下12 000 r/min离心15 min，获得的上清即为粗酶液。, http://www.100md.com(程 贻 陈车生 吴乾一 赵 健 袁勤生)
关键词：重组人锰超氧化物歧化酶；大肠杆菌；离子交换层析
中图分类号：Q554文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)07-0001-05
Study on Purification Condition of Recombinant Human Manganese Superoxide Dismutase
, http://www.100md.com
CHENG Yi1,CHEN Che-sheng2, WU Qian-yi2, ZHAO Jian1*,YUAN Qin-sheng1
(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science & Technology, Shanghai 200237, China; 2. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China)
Abstract：Objective To study the purification method of recombinant human manganese superoxide dismutase(rhMn-SOD). Methods The cells were fragmented by ultrasonic. The protein was precipitated by the thermal denaturation. The condition of proteins separation by DEAE ion exchange chromatography was optimized, then Sephadex G-100 molecular sieving was used to purify protein. Results The optimization condition of ultrasonic power was 300 W, the cycles of ultrasonic were 70 cycles, the best thermal denaturation was 75 ℃and time was 10 minutes. The optimal pH value of loading buffer solution of DEAE was 9.0, the elution buffer was 0.1mol/LNaCl. After G-100, the specific activity of rhMn-SOD wa℃s 4 411.706 U/mg and it was 5-fold higher than crude enzyme extract. Conclusion The convenient method of separation and purification of rhMn-SOD is obtained.
, 百拇医药
Key words：recombinant human manganese superoxide dismutase; Escherichia coli; ion exchange chromatography
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一类广泛存在于生物界的金属酶类[1]，是生物体防御活性氧(ROS)毒害的关键性防线，能催化超氧阴离子(O2.-)发生歧化反应，从而清除O2.-。具有抗衰老、防辐射及治疗炎症等一系列功能，已被广泛应用于食品及医疗保健行业[2]。真核细胞内的SOD主要有Cu，Zn，SOD和Mn-SOD 等。Mn-SOD存在于线粒体中，近年研究发现，Mn-SOD与炎症、衰老及肿瘤等多种疾病有关[3，4]。传统的Mn-SOD纯化方法较繁琐且费时费力，不利于规模化生产[5]。本课题组前期已经构建表达质粒pET-Mn-SOD并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌[6]，在摇瓶中进行了IPTG诱导表达条件的研究[7]及不同诱导剂的比较研究[8]，系统研究了乳糖诱导高效表达Mn-SOD的发酵培养条件。本实验在此基础上，利用rhMn-SOD对热稳定的性质，用热变性法替代传统的硫酸铵分级沉淀蛋白质，并通过DEAE离子交换层析和葡聚糖凝胶G100分子筛进一步纯化分离，探讨了重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的纯化条件，建立了简便快捷且有利于规模化生产rhMn-SOD的方法。
, http://www.100md.com
1材料与方法
1.1菌株
含rhMn-SOD表达质粒的基因工程菌株，由本室施惠娟等构建并保存。
1.2试剂
DEAE-Sepharose Fast Flow(法玛西亚公司)；葡聚糖凝胶G-100(Whatman公司)；牛血清白蛋白，硫酸卡那霉素(上海源聚生物科技有限公司)；连苯三酚(E. Merk)；丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺(Fluka公司)；考马斯亮蓝G250，R250(Fluka公司)；其余为国产分析纯试剂。
1.3仪器
Model J2-21M型高速冷冻离心机(Beckman公司)；JY 92-Ⅱ超声波细粉破碎机(宁波新芝科器研究所)；HYG-Ⅱ回转式恒温调速摇瓶培养柜(上海新蕊自动化设备有限公司)；JM-250电泳仪(大连捷迈科建有限公司)； UV-2100紫外分光光度计(UNICO)。
, 百拇医药
1.4方法
1.4.1粗酶液的制备接种可表达rhMn-SOD的基因工程菌E.coli BL21(DE3)(含有pET24a(+)质粒)单菌落于含50μg/mL 卡那霉素的LB培养液，37 ℃振荡培养12 h后，按1%接种量将活化菌转移入LB培养基中(含50μg/mL 卡那霉素)，37 ℃，200 r/min摇床培养12 h，作为种子液。以5%的接种量接入种子液，37 ℃，200 r/min摇床进行二级培养。至A600约为2.2时用终浓度为0.25%的乳糖和2 mmol/L MnCl2诱导表达，诱导后6 h终止培养。离心收集菌体，称重。按1:10的比例将菌体悬浮于pH 9.0的0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液中，冰浴中用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声功率为300 W，每次工作5 s，间隔5 s，循环70次。超声液在4 ℃下12 000 r/min离心15 min，获得的上清即为粗酶液。, http://www.100md.com(程 贻 陈车生 吴乾一 赵 健 袁勤生)