海藻糖合成酶活性测定方法的研究
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摘要：目的研究一种测定海藻糖合成酶活性的方法。方法用薄层色谱法定性分析海藻糖合成酶反应体系中的海藻糖；用α-葡糖苷酶将麦芽糖水解为葡萄糖，DNS法测定还原糖，差值法计算海藻糖合成酶活性。结果获得了海藻糖合成酶活性的定性、定量分析方法，成功测定出粗酶液中海藻糖合成酶的活性。结论此方法设备简单，易于同时测定较多的样品，适用于实验室选育海藻糖合成酶产生菌时大量样品的测定。
关键词：海藻糖合成酶；差值法；α-葡糖苷酶；薄层色谱
中图分类号：Q559文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)05-0047-04
Research on Activity Measurement of Trehalose Synthase
DUAN Feng1, GAO Yan-hua1,YUAN Jian-guo2
(1. Jinan Jinglu Bio-technology Research and Development Center, Jinan 250013, China; 2. Shandong Food & Fermentation Industry Research & Design Institute, Jinan 250013, China)
Abstract：Objective To investigate a method for measuring the activity of trehalose synthase. Methods The qualitative analysis of trehalose was performed by thin layer chromatography (TLC); the quantitative analysis of activity of trehalose synthase was investigated by the difference of maltose and reducing sugar which was from the hydrolysis of maltose byα-glucosidase and measured by DNS. Results The qualitative and quantitative analysis methods were obtained for trehalose synthase and the activity of trehalose synthase in crude enzyme was determined successfully. Conclusion The method is simple and reasonable, can simultaneously determine more samples and fits to the mensuration of lots of samples during the selection of trehalose synthase-producing strain in common laboratory.
Key words：trehalose synthase; difference method; α-glucosidase; thin layer chromatography
海藻糖是由2个葡萄糖分子通过α-α，1→1键结合而成的非还原性双糖，结构稳定，化学惰性。海藻糖是优良的保鲜剂和保护剂，用于保存酶制剂、疫苗等生物制品效果显著，在食品、化妆品、医药、保健食品等行业有广泛的应用价值。目前生产海藻糖有发酵法和酶转化法两种方法。酶转化法生产海藻糖成本低、产率高、原料来源广，其研究重点是酶的发酵生产及酶的固定化。目前海藻糖合成酶活性的检测主要用高效液相色谱等方法，不仅受实验室设备条件的限制，而且对样品的纯度要求很高，给研究工作带来一定的困难[1-4]。
我们研究了海藻糖薄层色谱的定性检测方法，以及在海藻糖、麦芽糖、葡萄糖混合体系中用酶-DNS测定葡萄糖，差值法计算海藻糖的方法，成功测定出海藻糖合成酶的活性。
1材料与方法
1.1菌种
水生栖热菌(Thermus aquaticus)，本研究室保藏。
1.2主要原料和试剂
海藻糖(Sigma公司)；培养基为生化试剂，薄层色谱用试剂为色谱纯，其他化学试剂无特殊说明均为分析纯，水为蒸馏水。
DNS试剂：将3,5-二硝基水杨酸6.00 g，氢氧化钠 20.80 g溶解于800 mL蒸馏水中，依次加入酒石酸钾钠18.20 g、重蒸酚5.00 g、无水亚硫酸钠5.00 g，定容至1 000 mL，于棕色瓶中暗处放置7 d后，方可使用。
1.3主要仪器
7200型分光光度计；恒温水浴锅(±0.1℃)；高温摇床；高温培养箱；干燥箱；层析装置。
1.4培养方法
发酵培养基：牛肉膏0.5 %，胰蛋白胨0.5 %，硫酸铵0.2 %，硫酸镁0.05 %，磷酸氢二钾0.3 %，磷酸二氢钾0.1 %，pH 8.3。65 ℃培养40 h。
1.5酶活测定方法 ......
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