重组羧肽酶原B突变体C383A的纯化与性质研究
摘要：目的纯化羧肽酶原B突变体C383A并研究其酶学性质。方法用DEAE-FF离子交换树脂纯化C383A，测定其动力学参数，温度对酶活性的影响、温度稳定性、最适pH以及pH稳定性等酶学性质，并与野生型比较。结果纯化后获得高纯度突变体C383A，与野生型相比，催化效率及稳定性均有提高，但与底物的亲和力降低，随着温度的上升催化速率的增长率低于野生型。结论将重组羧肽酶原B第383位Cys突变为Ala可对酶的性质产生影响，与野生型比较，C383A提高了酶的催化效率及温度和pH稳定性。
关键词：重组羧肽酶原B；定点突变；纯化：酶学性质
中图分类号：Q555
文献标识码：A
文章编号：1672-979X(2010)09-0308-05
羧肽酶B(ca rbOXypeptida s e B，cPB)(EC3.4.17.2)属金属羧肽酶家族，是一种切割蛋白质或多肽c端Arg、Lys等碱性氨基酸残基的外肽酶，主要应用于蛋白质切割和测序以及疾病诊断，以及重组胰岛素的生产工艺中。
, 百拇医药
羧肽酶原B(45×10)由胰蛋白酶激活生成有催化活性的羧肽酶B(35×103)。制备羧肽酶B的传统方法是从动物胰脏中提取，繁琐且成本很高。我们已成功构建鼠源羧肽酶原B(pCPB)大肠杆菌BL21(DE3)高效表达菌株，以包涵体形式表达并成功复性。羧肽酶原B Cys383位点在c端a-螺旋二级结构中，此位点靠近酶活性中心。Cys383被Ala替换后，酶的催化域构象及电荷分布可能发生改变，从而影响其酶学性质。为弄清Cys383位点对酶的性质的影响，我们构建突变体c383A表达菌株，并研究了复性后纯化和酶学性质。
1材料与方法
1.1材料
LB培养基：1 L培养基含胰蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，氯化钠lOg。
PCR引物(上海生工生物公司合成)；DNA测序(上海英骏生物技术公司测定)；高保真酶pyrobestDNA polymerase、限制性内切酶、DNA连接酶T4Ligase[宝生物工程(大连)公司]。其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
1.2方法
1.2.1突变体C383A表达菌株的构建由于c y s 3 8 3位点位于c端，a一螺旋结构靠近c端，故以含野生型序列的质粒为模板，直接采用3’.端引物引入突变位点。引物设计为，5’端5’.CATGCCATGGAACATGCTTCCGAGGAGC-3’(含Nco I酶切位点)；3’端5’-CCCAAGCTTTCACTAATATAGATGTTCTCGGACATAATT GGCAATGTACTTGACTGCAAGCATTGTCTCCTCACGGTCTGGCGGA-3’(含Hindm酶切位点)，突变序列PCR扩增后连接至pET-28a(+)(Novagen)表达载体。选用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株(由本实验室保存)。
1.2.2酶活性及蛋白质浓度测定羧肽酶的活性测定根据Folk and Schirmer[71法，以马尿酰-L-精氨酸为底物，将25℃，1min催化降解1 umol马尿酰-L-精氨酸所需的酶量定义为1个酶活性单位(u)。蛋白质浓度用Bradford法测定，用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白。
, 百拇医药
1.2.3C383A的纯化用20 mmol/L Tris pH 8.0平衡DEAE.FF离子交换树脂，将复性液酶解过滤后上样，经Tris.HCI缓冲液平衡后，用含0～0.3 mmol/LNaCI的洗脱缓冲液连续梯度洗脱目的蛋白。
1.2.4C383A性质研究
1.2.4.1动力学参数测定 根据米氏方程利用双倒数法测定Km及V…，用马尿酰-L-精氨酸为底物(0.05-0.3 mmol/L)，测定条件均为25℃，至少重复3次。
1.2.4.2温度对酶活性的影响 底物溶液分别在4，25，30，40，50，60，70，80℃预置5 rain，然后分别加入酶液测活性。以底物温度25℃的酶活性为100%计算相对酶活性并与野生型比较。
1.2.4.3温度稳定性将纯化后浓度1 mg/mL的酶液分别置于4，25，30，40，50，60，70，80℃水浴中，每隔相同时间取样测定活性，以水浴前的酶液活性为100%计算残余酶活性并与野生型比较。
, 百拇医药
1.2.4.4最适pH底物分别溶解于pH 3.0～12.0的缓冲液中，于25℃测定纯化后的酶液活性。25 mmol/L醋酸.醋酸钠缓冲液(pH 3.0-6.0)，磷酸盐缓冲液(pH6.5～7.5)，Tris—HCl缓冲液(pH 8.0～8.5)，Gly—NaOH缓冲液(pH 9.5-12.0)，pH均在25℃配制。以底物在pH 7.65的酶活性为100%计算相对酶活性并与野生型比较。
1.2.4.5 pH稳定性将纯化后浓度1 mg/mL的酶液在25℃水浴置于pn 3.0-12.0缓冲液中12 h后，取样测定酶活性。25 mmol/L醋酸一醋酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，Gly-NaOH缓冲液均在25℃配制。以水浴前的初始酶活性为100%计算残余酶活性并与野生型比较。
2结果与分析
2.1C383A的构建与表达
, 百拇医药
PCR扩增结果见图1。用含有突变位点的引物使用高保真DNA聚合酶Pyrobest成功扩增出含有突变位点的目的条带。 将突变序列连接至pET-28a(+)空载并转化至BL2 1(DE3)菌株表达。C383A表达菌株的表达鉴定结果见图2，加入IPTG后成功实现C383A的表达。菌体超声破碎后上清中没有目的条带，C383A仍以包涵体形式表达。
2.2C383A酶解后纯化
用含0～0.3 mmol/L NaCl洗脱缓冲液连续梯度洗脱，收集活性C383A峰，洗脱曲线见图3，SDS-PAGE检测结果见图4。C383A达到很高纯度，SDS-PAGE检测无杂带，活性达到556 U/mL。 C383A经离子交换树脂DEAE-FF纯化结果见表1，纯化后蛋白回收率62.6%，酶活回收率80.4%。
2.3 C383A与野生型性质比较
, http://www.100md.com 2.3.1动力学参数测定C383A与野生型动力学参数比较结果见表2。C383A的Km、Vmax、kcat/Km(表明酶催化效率的参数)均大于野生型。表明羧肽酶原BCys383位点突变为Ala后，酶与底物的亲和力降低，但催化效率有所提高。
2.3.2温度对酶活性的影响温度对酶活性的影响测定结果见图5。C383A和野生型的反应速率均随温度升高而提高，但野生型的提高速率明显大于C383A。这主要是因温度升高后酶与底物的分子碰撞加剧，野生型与底物的亲和力较高致催化速率较高。
2.3.3温度稳定性温度低于40℃时，C383A与野生型活性均较稳定；40℃温育8 h后，C383A和野生型活性均降低，野生型活性损失较快，见图6(a)：温度升至50℃时，温育2 h后C383A与野生型活性均下降，野生型活性下降速率明显大于C383A，见图6(b)；温度升至60℃时，野生型刚水浴就几乎丧失了全部活性，而C383A在60℃条件下温育30 min仍具有约20%的活性，见图6(c)。可见C383A热稳定性更好。
, http://www.100md.com
2.3.4最适pH C383A最适pH与野生型相近，见图7。但pH 6.0-7.5时C383A的催化效率明显高于野生型；pH<6.0的酸性环境下，C383A与野生型活性都基本丧失；pH>8.0的碱性环境下，c383A催化效率高于野生型。认为C383A的催化范围比野生型广泛。Cys383位点突变为Ala后，酶催化域的微环境可能发生改变，使得C383A在更广的pH范围内有较高的催化能力。
2.3.5 pH稳定性C383A与野生型的pH稳定性测定结果见图8。两者在pH 5.0～9.0范围内均很稳定，但在pH<5.O和pH>9.0的较强酸碱条件下活性均降低，C383A活性降低的程度小于野生型。Ala取代Cys383后，可能影响酶分子表面局部电荷分布，而这种局部的变化使C383A有较强的pH稳定性但不显著，其稳定性随pH值变化的总趋势仍与野生型相似。
3讨论
重组羧肽酶原B的Cys383位点在c端a-螺旋结构中靠近酶催化结构域。Cys383被其它氨基酸替代后c端a-螺旋结构内局部基团间作用力会发生变化，从而可能会对催化域产生影响使酶的性质发生改变。我们研究C383A的酶学性质并与野生型比较，表明C383A催化效率和稳定性都有提高，这为进一步研究重组羧肽酶原B突变体奠定了基础。, 百拇医药(张洛盛 吴 珊 吴 倩 李素霞)
关键词：重组羧肽酶原B；定点突变；纯化：酶学性质
中图分类号：Q555
文献标识码：A
文章编号：1672-979X(2010)09-0308-05
羧肽酶B(ca rbOXypeptida s e B，cPB)(EC3.4.17.2)属金属羧肽酶家族，是一种切割蛋白质或多肽c端Arg、Lys等碱性氨基酸残基的外肽酶，主要应用于蛋白质切割和测序以及疾病诊断，以及重组胰岛素的生产工艺中。
, 百拇医药
羧肽酶原B(45×10)由胰蛋白酶激活生成有催化活性的羧肽酶B(35×103)。制备羧肽酶B的传统方法是从动物胰脏中提取，繁琐且成本很高。我们已成功构建鼠源羧肽酶原B(pCPB)大肠杆菌BL21(DE3)高效表达菌株，以包涵体形式表达并成功复性。羧肽酶原B Cys383位点在c端a-螺旋二级结构中，此位点靠近酶活性中心。Cys383被Ala替换后，酶的催化域构象及电荷分布可能发生改变，从而影响其酶学性质。为弄清Cys383位点对酶的性质的影响，我们构建突变体c383A表达菌株，并研究了复性后纯化和酶学性质。
1材料与方法
1.1材料
LB培养基：1 L培养基含胰蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，氯化钠lOg。
PCR引物(上海生工生物公司合成)；DNA测序(上海英骏生物技术公司测定)；高保真酶pyrobestDNA polymerase、限制性内切酶、DNA连接酶T4Ligase[宝生物工程(大连)公司]。其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
1.2方法
1.2.1突变体C383A表达菌株的构建由于c y s 3 8 3位点位于c端，a一螺旋结构靠近c端，故以含野生型序列的质粒为模板，直接采用3’.端引物引入突变位点。引物设计为，5’端5’.CATGCCATGGAACATGCTTCCGAGGAGC-3’(含Nco I酶切位点)；3’端5’-CCCAAGCTTTCACTAATATAGATGTTCTCGGACATAATT GGCAATGTACTTGACTGCAAGCATTGTCTCCTCACGGTCTGGCGGA-3’(含Hindm酶切位点)，突变序列PCR扩增后连接至pET-28a(+)(Novagen)表达载体。选用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株(由本实验室保存)。
1.2.2酶活性及蛋白质浓度测定羧肽酶的活性测定根据Folk and Schirmer[71法，以马尿酰-L-精氨酸为底物，将25℃，1min催化降解1 umol马尿酰-L-精氨酸所需的酶量定义为1个酶活性单位(u)。蛋白质浓度用Bradford法测定，用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白。
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1.2.3C383A的纯化用20 mmol/L Tris pH 8.0平衡DEAE.FF离子交换树脂，将复性液酶解过滤后上样，经Tris.HCI缓冲液平衡后，用含0～0.3 mmol/LNaCI的洗脱缓冲液连续梯度洗脱目的蛋白。
1.2.4C383A性质研究
1.2.4.1动力学参数测定 根据米氏方程利用双倒数法测定Km及V…，用马尿酰-L-精氨酸为底物(0.05-0.3 mmol/L)，测定条件均为25℃，至少重复3次。
1.2.4.2温度对酶活性的影响 底物溶液分别在4，25，30，40，50，60，70，80℃预置5 rain，然后分别加入酶液测活性。以底物温度25℃的酶活性为100%计算相对酶活性并与野生型比较。
1.2.4.3温度稳定性将纯化后浓度1 mg/mL的酶液分别置于4，25，30，40，50，60，70，80℃水浴中，每隔相同时间取样测定活性，以水浴前的酶液活性为100%计算残余酶活性并与野生型比较。
, 百拇医药
1.2.4.4最适pH底物分别溶解于pH 3.0～12.0的缓冲液中，于25℃测定纯化后的酶液活性。25 mmol/L醋酸.醋酸钠缓冲液(pH 3.0-6.0)，磷酸盐缓冲液(pH6.5～7.5)，Tris—HCl缓冲液(pH 8.0～8.5)，Gly—NaOH缓冲液(pH 9.5-12.0)，pH均在25℃配制。以底物在pH 7.65的酶活性为100%计算相对酶活性并与野生型比较。
1.2.4.5 pH稳定性将纯化后浓度1 mg/mL的酶液在25℃水浴置于pn 3.0-12.0缓冲液中12 h后，取样测定酶活性。25 mmol/L醋酸一醋酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲液，Tris-HCl缓冲液，Gly-NaOH缓冲液均在25℃配制。以水浴前的初始酶活性为100%计算残余酶活性并与野生型比较。
2结果与分析
2.1C383A的构建与表达
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PCR扩增结果见图1。用含有突变位点的引物使用高保真DNA聚合酶Pyrobest成功扩增出含有突变位点的目的条带。 将突变序列连接至pET-28a(+)空载并转化至BL2 1(DE3)菌株表达。C383A表达菌株的表达鉴定结果见图2，加入IPTG后成功实现C383A的表达。菌体超声破碎后上清中没有目的条带，C383A仍以包涵体形式表达。
2.2C383A酶解后纯化
用含0～0.3 mmol/L NaCl洗脱缓冲液连续梯度洗脱，收集活性C383A峰，洗脱曲线见图3，SDS-PAGE检测结果见图4。C383A达到很高纯度，SDS-PAGE检测无杂带，活性达到556 U/mL。 C383A经离子交换树脂DEAE-FF纯化结果见表1，纯化后蛋白回收率62.6%，酶活回收率80.4%。
2.3 C383A与野生型性质比较
, http://www.100md.com 2.3.1动力学参数测定C383A与野生型动力学参数比较结果见表2。C383A的Km、Vmax、kcat/Km(表明酶催化效率的参数)均大于野生型。表明羧肽酶原BCys383位点突变为Ala后，酶与底物的亲和力降低，但催化效率有所提高。
2.3.2温度对酶活性的影响温度对酶活性的影响测定结果见图5。C383A和野生型的反应速率均随温度升高而提高，但野生型的提高速率明显大于C383A。这主要是因温度升高后酶与底物的分子碰撞加剧，野生型与底物的亲和力较高致催化速率较高。
2.3.3温度稳定性温度低于40℃时，C383A与野生型活性均较稳定；40℃温育8 h后，C383A和野生型活性均降低，野生型活性损失较快，见图6(a)：温度升至50℃时，温育2 h后C383A与野生型活性均下降，野生型活性下降速率明显大于C383A，见图6(b)；温度升至60℃时，野生型刚水浴就几乎丧失了全部活性，而C383A在60℃条件下温育30 min仍具有约20%的活性，见图6(c)。可见C383A热稳定性更好。
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2.3.4最适pH C383A最适pH与野生型相近，见图7。但pH 6.0-7.5时C383A的催化效率明显高于野生型；pH<6.0的酸性环境下，C383A与野生型活性都基本丧失；pH>8.0的碱性环境下，c383A催化效率高于野生型。认为C383A的催化范围比野生型广泛。Cys383位点突变为Ala后，酶催化域的微环境可能发生改变，使得C383A在更广的pH范围内有较高的催化能力。
2.3.5 pH稳定性C383A与野生型的pH稳定性测定结果见图8。两者在pH 5.0～9.0范围内均很稳定，但在pH<5.O和pH>9.0的较强酸碱条件下活性均降低，C383A活性降低的程度小于野生型。Ala取代Cys383后，可能影响酶分子表面局部电荷分布，而这种局部的变化使C383A有较强的pH稳定性但不显著，其稳定性随pH值变化的总趋势仍与野生型相似。
3讨论
重组羧肽酶原B的Cys383位点在c端a-螺旋结构中靠近酶催化结构域。Cys383被其它氨基酸替代后c端a-螺旋结构内局部基团间作用力会发生变化，从而可能会对催化域产生影响使酶的性质发生改变。我们研究C383A的酶学性质并与野生型比较，表明C383A催化效率和稳定性都有提高，这为进一步研究重组羧肽酶原B突变体奠定了基础。, 百拇医药(张洛盛 吴 珊 吴 倩 李素霞)