Egr-1的诱骗性脱氧核苷酸对大鼠颈总动脉损伤后内膜增生的影响(1)
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[摘要]目的：针对大鼠Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN)，作用于损伤后的动脉内膜，观察其对血管损伤后新生内膜增生的影响。方法：行HE染色观察血管内膜、中膜的厚度改变，并分组进行计算机图象分析，计算出内膜/中膜(I/M)的面积比。结果：治疗组与同一时间点对照治疗组和对照组相比，内膜增生受到抑制，两者之间差异有显著性(P<0.01)。结论：decoy ODN通过诱骗转录因子与它结合，下调转录因子所调控的基因表达，减轻了大鼠动脉损伤后新生内膜的增生程度。
[关键词]诱骗性寡脱氧核苷酸；Egr-1；动脉；血管内膜；大鼠
[中图分类号]R363 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210(2007)06(b)-133-02
20世纪90年代以后核糖核酸研究发展极为迅速，新技术不断出现。现在有寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide ODN)、核酶(ribozyme)、诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,decoy ODN)等。诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy oligodeoxynucleotide,decoy ODN)是一种顺式作用元件，与转录因子DNA结合位点的序列相同或相似，在与转录因子与内源顺式DNA序列元件竞争，诱骗转录因子与它结合，下调转录因子所调控的基因表达[1]。早期生长反应因子-1(early growth response factor-1, Egr-1)是立早基因(IEGs)家族的一员，是一种重要的核转录因子，调控着多种与细胞增殖相关基因的表达，因此与细胞增殖关系密切[2]。本研究设计了针对大鼠Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN)，作用于损伤后的动脉内膜，观察其对血管损伤后新生内膜增生的影响。
1 实验材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大白鼠96只，由中国医科大学实验动物中心提供，体重350～400 g。喂食标准饲料，自由饮水。
1.2 主要试剂
①诱骗性寡脱氧核苷酸(上海博亚生物技术有限公司合成)②转染试剂FuGENE6(购自Roche公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 大鼠动脉损伤的模型制作健康雄性Wistar大白鼠96只，体重350～400 g。麻醉后，颈正中切开，钝性分离左颈总动脉，血管夹暂时阻断左颈总动脉近心、远心端血流，用2 F导管从颈外动脉插入左颈总动脉内，推入0.2 ml生理盐水充盈气囊，反复抽拉球囊3次，造成左颈总动脉内膜损伤。术后结扎颈外动脉，恢复血流，缝合颈部创口。局部使用青霉素以预防感染，喂食标准饲料，自由饮水。
1.3.2 分组及处理96只雄性Wistar大白鼠随机分为4组，每组24只。Decoy ODN+FuGene 6治疗组：球囊拉伤左颈总动脉后，应用微量注射器局部释放200 μl含有500 μg FITC标记的decoy ODN、30 μl 转染试剂FuGene 6的1 mmol/L MgCl2溶液，使其在局部作用20 min。对照组(FuGene 6+MgCl2)：球囊拉伤左颈总动脉后局部注入200 μl含30 μl FuGene 6转染试剂的1 mmol/L MgCl2液。对照治疗组：球囊拉伤左颈总动脉后，应用微量注射器局部释放200 μl含有500 μg FITC标记的对照decoy ODN、30 μl 转染试剂FuGene 6的1 mmol/L MgCl2溶液，使其在局部作用20 min。假手术组：只进行颈动脉结扎，但不插入导管，即不造成动脉内膜损伤。而对照组是为稀释液和转染液而设计的对照。并于术后3、7、14、21d分别处死各组动物6只。
1.3.3 Egr-1的诱骗性寡脱氧核苷酸(decoy ODN) 的合成由上海博亚生物技术有限公司合成，经聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PACE)纯化，冻干保存。其碱基序列为：
egr-1 decoy ODN的基因序列为：
5′_TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG_3′对合
5′_CCCTTAGCGGGGGCGAGGGCGA_3′。
对照基因的序列为：
5′_AGCCGCACCGGCCTGCCTCGTC _3′对合
5′_GACGAGGCAGGCCGGTGCGGCT_3′。
两侧下划线所示部分为寡核苷酸识别序列。在其3′端和5′端各有两个磷酸二酯键进行硫代修饰，其中1 000 μg decoy ODN的5′端用FITC标记，以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。
1.3.4 在体decoy ODN转染室温下分别将500 μg decoy ODN及对照基因与30 μl转染试剂FuGene 6充分混合成复合物后溶于170 μl 的1 mmol/L MgCl2液中，在制作血管球囊损伤模型的同时，从颈外动脉给予。可在荧光显微镜下观察转染情况。转染治疗24 h后处死大鼠2只，立即取治疗局部的血管放入液氮罐中，经冰冻切片(片厚5 μm)后，避光于荧光显微镜下观察。
1.3.5 血管形态学检测于不同的时间点取材，病变血管标本经10%中性福尔马林固定后，经60%、70%、80%、90%、100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，制成蜡块，连续切片(片厚4 μm)，行HE染色观察血管内膜、中膜的厚度改变，并分组进行计算机图象分析，计算出内膜/中膜(I/M)的面积比。图象分析由操作熟练但不知情者操作。
1.4 统计学处理
所有数据采用SPSS11.5软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，均数比较采用单因素方差分析 ......
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