脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究(1)
(第三军医大学大坪医院野战外科研究所神经内科，重庆400042)
摘要：目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT—PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CD11b，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musshi-1表达明显增强(P<0.05)，48h达高峰，然后逐渐减弱：细胞接种后12周，在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs。分离后可以体外扩增，诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。
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关键词：脐血单个核细胞；神经干细胞；诱导分化；巢蛋白：致瘤性
中图分类号：R741
干细胞是指具有自我更新与多向分化潜能的细胞，它们在细胞疗法、基因治疗、发育学研究、药理及毒理学等研究中己显示出无可比拟的作用和优越性。近年来，神经干细胞fneural stem eells,NSCs)移植治疗中枢神经系统疾病引起人们的普遍关注，在动物实验中获得了较好的疗效，NSCs被认为是治疗神经系统疾病的良好载体。但是，由于来源的局限，NSCs的应用受到限制。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为原组织所有细胞类型的未分化细胞。根据其发育潜能可分为全能干细胞、多胚层多能干细胞、单胚层多能干细胞和定向专能干细胞。存在于骨髓基质中的间质干细胞(mesenehymal stem cdls,MSCs)是研究最早和最为深入的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有广泛的分化潜能，已经有多项研究显示，外源骨髓MSCs移植入脑内，可以分化为神经细胞。表达神经元特异性标志蛋白。因为脐带血来源的MSCs和骨髓MScs有极其一致的生物学特性，且易于采集、制备及保存。免疫反应性低，因此可能更易于在临床上使用。本研究结合密度梯度离心和体外贴壁生长的方法得到脐血MSCs，诱导后检测其NSCs标志物Nesfin及Musashi-I的表达情况，并将培养后的脐血MSCs接种于裸鼠皮下，观察脐血MSCs对裸鼠的致瘤性，为应用于组织及其功能修复中提高该细胞的生物安全性提供新的依据。
, 百拇医药
1.材料和方法
1.1主垂试剂
高糖IMDM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴细胞分层液(Cibco公司)；RNA提取试剂Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、异丙醇为国产分析纯试剂；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；琼脂糖(sigma公司)。
1.2实验方法
1.2.1脐血间质干细胞的体外分离和扩增培养无菌条件下采集健康产妇足月妊娠顺产或剖腹产的婴儿脐带血50～100md肝素抗凝，与0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混匀，再与3%的明胶1:1混匀，静置60min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2000dr/min离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤3次，弃上清。所得细胞以1.0x102/cm2(T-25培养瓶)的密度接种于含有15%胎牛血清的IMDM培养液(Hyclone公司，置于37℃、体积分数为5%的cm2、饱和湿度的孵箱内培养，3d后换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，用倒置显微镜观察细胞形态的改变并照相。待细胞长到80%融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后传代。
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收集分离后1h、培养后36、48、72h和5d的细胞，离心洗涤，在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。
1.2.2流式细胞仪检测取扩增一代的脐血间质干细胞，PBS洗涤后用2.5 WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的单细胞悬液，共7管，1号管和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE单克隆抗体各5ml，其余5管分别加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44单抗各5m1.室温下孵育20min，流式细胞仪检测。
1.2.3脐血间质干细胞的诱导分化取原代细胞，加入20ng/m1 NGF和RA联合诱导培养，收集诱导前，诱导后36、48、72 h、5d的细胞，调整细胞密度备用。
1.2.4 RNA提取取诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞各3x106个，融于1 mlTRIZOL试剂中，用吸管反复吹打后室温下孵育5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后室温下10min。4℃，12000r/min离心15min后将上层无色液体移入新的EP管中。加入异丙醇，室温下放置10min，4℃，12000r/min离心10min弃去上清。加入75%乙醇，4℃，7500r/min离心5min，弃去上清液，风干，加入DEPC处理的纯净水40μl溶解后，55℃孵育15min。
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1.2.5 RT-PCR采用相关软件设计引物，并由赛百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC—TACCTCC 3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。对所提RNA进行定量，取1μgRNA转录成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCR buffer 1μl，RNase free H2O 3.75μl，dNTP lμ，RNase inhibor0.25μl，AMV逆转录酶0.5μl，oli-.go-dT接头引物0.5μl，RNA样品1μg，按照如下条件进行逆转录反应30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA进行PCR扩增。在EP管中依次加入下列物质：Taq酶0.25μl，10xPCR buffer10μl，纯净水27.75μl，, 百拇医药(向 静 王昌铭 王景周)
摘要：目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT—PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CD11b，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musshi-1表达明显增强(P<0.05)，48h达高峰，然后逐渐减弱：细胞接种后12周，在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs。分离后可以体外扩增，诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。
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关键词：脐血单个核细胞；神经干细胞；诱导分化；巢蛋白：致瘤性
中图分类号：R741
干细胞是指具有自我更新与多向分化潜能的细胞，它们在细胞疗法、基因治疗、发育学研究、药理及毒理学等研究中己显示出无可比拟的作用和优越性。近年来，神经干细胞fneural stem eells,NSCs)移植治疗中枢神经系统疾病引起人们的普遍关注，在动物实验中获得了较好的疗效，NSCs被认为是治疗神经系统疾病的良好载体。但是，由于来源的局限，NSCs的应用受到限制。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为原组织所有细胞类型的未分化细胞。根据其发育潜能可分为全能干细胞、多胚层多能干细胞、单胚层多能干细胞和定向专能干细胞。存在于骨髓基质中的间质干细胞(mesenehymal stem cdls,MSCs)是研究最早和最为深入的一类多能干细胞，其来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有广泛的分化潜能，已经有多项研究显示，外源骨髓MSCs移植入脑内，可以分化为神经细胞。表达神经元特异性标志蛋白。因为脐带血来源的MSCs和骨髓MScs有极其一致的生物学特性，且易于采集、制备及保存。免疫反应性低，因此可能更易于在临床上使用。本研究结合密度梯度离心和体外贴壁生长的方法得到脐血MSCs，诱导后检测其NSCs标志物Nesfin及Musashi-I的表达情况，并将培养后的脐血MSCs接种于裸鼠皮下，观察脐血MSCs对裸鼠的致瘤性，为应用于组织及其功能修复中提高该细胞的生物安全性提供新的依据。
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1.材料和方法
1.1主垂试剂
高糖IMDM培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；淋巴细胞分层液(Cibco公司)；RNA提取试剂Tfizol(invit-rogen公司)；氯仿、异丙醇为国产分析纯试剂；DEPC水(sigma公司)；RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；琼脂糖(sigma公司)。
1.2实验方法
1.2.1脐血间质干细胞的体外分离和扩增培养无菌条件下采集健康产妇足月妊娠顺产或剖腹产的婴儿脐带血50～100md肝素抗凝，与0.01moL/pH7.4的PBS按1:1混匀，再与3%的明胶1:1混匀，静置60min沉降红细胞。吸上清离心，弃上清，用PBS制成单细胞悬液，叠加到相对密度1.077的淋巴细胞分离液上，2000dr/min离心20min，取界面层，加PBS制成单细胞悬液，离心洗涤3次，弃上清。所得细胞以1.0x102/cm2(T-25培养瓶)的密度接种于含有15%胎牛血清的IMDM培养液(Hyclone公司，置于37℃、体积分数为5%的cm2、饱和湿度的孵箱内培养，3d后换液，弃去悬浮细胞，贴壁细胞继续培养，用倒置显微镜观察细胞形态的改变并照相。待细胞长到80%融合时，用2.5g/L的胰蛋白酶消化后传代。
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收集分离后1h、培养后36、48、72h和5d的细胞，离心洗涤，在显微镜下，台盼蓝染色、计数，调整细胞密度备用。
1.2.2流式细胞仪检测取扩增一代的脐血间质干细胞，PBS洗涤后用2.5 WE的胰蛋白酶消化后制成1:0x106的单细胞悬液，共7管，1号管和2号管为阴性对照，分别加入抗鼠的IgG-FITC和IgG-PE单克隆抗体各5ml，其余5管分别加入抗人的CD34-PE，CD31-FITC，CDl3-PE，CD29-PE，CD44单抗各5m1.室温下孵育20min，流式细胞仪检测。
1.2.3脐血间质干细胞的诱导分化取原代细胞，加入20ng/m1 NGF和RA联合诱导培养，收集诱导前，诱导后36、48、72 h、5d的细胞，调整细胞密度备用。
1.2.4 RNA提取取诱导前，诱导后36、48、72h、5d的细胞各3x106个，融于1 mlTRIZOL试剂中，用吸管反复吹打后室温下孵育5min。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡后室温下10min。4℃，12000r/min离心15min后将上层无色液体移入新的EP管中。加入异丙醇，室温下放置10min，4℃，12000r/min离心10min弃去上清。加入75%乙醇，4℃，7500r/min离心5min，弃去上清液，风干，加入DEPC处理的纯净水40μl溶解后，55℃孵育15min。
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1.2.5 RT-PCR采用相关软件设计引物，并由赛百盛生物工程公司合成。Nestin上游引物：5TCCTTTGACTTrCCTTGTC—TACCTCC 3，下游引物：5AAATCTGAAACTCAAGCACCA3：Musashi-l上游引物5TAATTCCTGTCCAGCAGTCTC3：下游引物5GAACCATCCCGTCCTGTATCAT3。对所提RNA进行定量，取1μgRNA转录成cDNA，在EP管中先后加入MgCL2×PCR buffer 1μl，RNase free H2O 3.75μl，dNTP lμ，RNase inhibor0.25μl，AMV逆转录酶0.5μl，oli-.go-dT接头引物0.5μl，RNA样品1μg，按照如下条件进行逆转录反应30℃10min，48℃50min，99℃5min，50℃5min。合成的cDNA进行PCR扩增。在EP管中依次加入下列物质：Taq酶0.25μl，10xPCR buffer10μl，纯净水27.75μl，, 百拇医药(向 静 王昌铭 王景周)