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编号:11528233
啮齿类小鼠γ-干扰素原核表达、纯化及功能鉴定(1)
http://www.100md.com 2008年2月24日 刘小会 陈卓佳 杜 军
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    参见附件(991KB,4页)。

     [摘要] 目的:构建γ-干扰素的高效原核表达载体,进行γ-干扰素表达、纯化和鉴定,并探索优化啮齿类γ-干扰素的制备工艺。方法:用RT-PCR技术,从ConA活化的小鼠脾细胞中扩增出mIFN-γcDNA,与原核表达载体pET30a(+)重组,表达和纯化重组蛋白His6-mIFN-γ,并用Western Blot检测该重组蛋白的生物学活性。结果:构建了啮齿类γ-干扰素的高效原核表达载体,并实现了γ-干扰素的可溶性表达,且验证该γ-干扰素具有生物学活性。结论:成功优化了生产干扰素的工艺,为国内外进行γ-干扰素研究奠定基础。

    [关键词] γ-干扰素;原核表达;纯化

    [中图分类号] TQ929+.1[文献标识码]A[文章编号]1673-7210(2008)01(a)-011-03

    Prokaryotic expression and purification of murine interferon-gamma

    LIU Xiao-hui, CHEN Zhuo-jia, DU Jun

    (Department of Microbiology and Biopharmaceutics in School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou

    510080,China)

    [Abstract] Objective:To clone murine interferon-gamma gene, do effective prokaryotic expression and purify recombinant murine IFN-γ for further study.Methods:To amplify mIFN-γcDNA from ConA-activated murine splenocytes by RT-PCR and clone into pET30a(+) vector.Then the target protein His6-mIFN-γ was induced by IPTG and purified with Ni2+-NTA agarose. The biologic activity was identified by western blotting.Results:The prokaryotic expression system of mIFN-γ was constructed.And the fusion protein mIFN-γ was dissoluble and bioactive.Conclusion:The technology of mIFN-γ production is successfully optimized. It lays a foundation of further research of IFN-γ.

    [Key Words] IFN-γ;Prokaryotic expression;Purification

    英国国立医学研究所的Isancs和Lindenman在研究病毒的干扰现象时发现了一种可溶性物质,进一步研究表明这一物质能够抑制多种病毒在细胞内的繁殖,于是将其命名为干扰素(interferons,IFN)[1]。干扰素是一类由低分子可溶性蛋白组成的重要细胞因子,自1957年Isancs首次发现鸡干扰素以来,先后已有人、鼠、犬以及猪等动物的干扰素基因被成功克隆。IFN-γ具有很强的抗病毒活性、免疫调节活性和抗肿瘤活性。IFN-γ可通过多种途径来发挥抗肿瘤作用,既通过延长细胞周期以延缓肿瘤细胞的生长和繁殖;又可通过抑制癌基因的表达来阻止或减慢肿瘤细胞的转化过程;还可诱导肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)上调癌细胞对TNF受体、MHCⅡ类抗原等的表达,使其易被杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)识别而被杀伤[2]。

    当病原体侵入机体组织后,淋巴细胞在感染部位聚集并释放干扰素等细胞因子。IFN-γ主要通过JAK-STAT途径来发挥作用的。IFN-γ与几乎分布于所有正常细胞表面的高亲合力的受体IFN-γR(IFNGR)结合并使受体发生二聚化后,受体的胞内近膜区可与胞浆内非受体TPK-JAK激酶(janus kinase)结合并发生磷酸化,进而与信号转导和转录激活因子1(signal transducers and activators of transcription,STAT-1)相结合。在JAK催化下,STAT-1结合成活化的STAT-1二聚体转移入核,他们通过与IFN-γ活化位点 (gamma-interferon activation sites,GAS) 结合而诱导免疫活性蛋白表达,如CD54、吲哚胺2,3-二加氧酶[3](idoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)等。

    据资料显示,我国在啮齿类γ-干扰素的克隆、制作方面还赶不上其他国家。尽管国外已经制备有基因重组啮齿类γ-干扰素,但是由于其开发成本高、前期投入大,用于肿瘤药物的基础研究,价格相当昂贵 ......

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