喀什0507JS32病毒的分离鉴定(1)
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[摘要] 2005年7~8月，在喀什地区采集蚊虫进行病毒分离，从当地居民家畜圈采集的一组库蚊分离到0507JS32病毒，该病毒对C6/36细胞致病变，而对Vero细胞不致病变。电镜观察显示，完整病毒颗粒呈球形，直径55 nm，无包膜，衣壳表面壳粒结构明显。基因组核酸电泳显示基因组为12节段双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)。利用辽宁病毒(Liaoning virus, LNV)第12基因片段特异性引物对病毒RNA进行RT-PCR扩增，PCR产物进行序列测定，所得核酸序列进行BLAST比较，结果显示，与LNV病毒第12基因片段核酸序列同源性大于89%，证实该病毒为LNV病毒。
[关键词] 喀什；库蚊；辽宁病毒
[中图分类号] R373[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)03(c)-021-03
Identification of 0507JS32 virus isolated in Kashi
LU Xinjun, LU Zhi, SUN Xiaohong, FU Shihong, WANG Huanqin, LIANG Guodong
(Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing100052, China)
[Abstract] Mosquitoes were collected for virus isolation in Kashi from July to August 2005. 0507JS32 virus was isolated from a pool of Culex sp. collected in barn, which could cause cytopathic effects (CPEs) on C6/36 cells but not Vero cells. Viral particles had no envelope and appeared round with diameter of about 55 nm. Capsomeres on the surface of capsid were clearly visible. Electrophoresis of viral genome showed a profile of 12 dsRNA segments. Specific primers of twelfth genomic segment of LNV were used for RT-PCR of viral RNA. The sequences of PCR products were compared by BLAST and showed similarity of over 89% with the sequences of LNV in GeneBank. So 0507JS32 virus was identified as LNV.
[Key words] Kashi; Culex; Liaoning virus
呼肠孤病毒(Reoviridae)是一类基因组为多节段dsRNA的病毒。部分呼肠孤病毒是以蚊、蜱为传播媒介的虫媒病毒，其中个别成员可经媒介蚊、蜱传播给人畜，引起人畜共患病(Zoonose)[1]。近年来，国内云南、辽宁等地先后在患病人畜的血清、脑脊液和蚊、蜱标本中分离到一些dsRNA病毒[2-4]，初步研究显示，这些病毒的基因组有10或12个dsRNA片段，属于呼肠孤病毒科，可能与当地的人畜共患病有关。2005年7～8月，我室在喀什地区采集蚊虫标本进行病毒分离，0507JS32是研究中分离的一株病毒，经鉴定为12节段dsRNA病毒，属于呼肠孤病毒科中新近界定的东南亚12节段dsRNA病毒属(Seadornavirus)辽宁病毒(Liaoning virus, LNV)。
1 材料与方法
1.1 标本采集、保存和运输
2005年7~8月，在新疆喀什地区喀什市和伽师县采集蚊虫标本。当地的主要生态环境包括果园、瓜地、林地、畜圈、人居，在这些生态环境中分别采集蚊虫。蚊虫采集后在存活状态下放入-20℃冰箱冷冻30 min，取出后迅速分类，每50～100只分装1支冻存管，置液氮中保存。采用干冰埋藏的方法将这些标本空运至我室，转入液氮中保存备用。
1.2 病毒分离
C6/36、Vero细胞系由本室保存，DMEM、RPMI 1640培养液购自Hyclone公司，胎牛血清(fetal serum of bovine, FBS)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，100 U/ml青霉素和链霉素双抗混和液、0.25%胰酶液、0.02%Versene液由本所配液室提供，常规进行细胞培养。在冷冻和无菌条件下研磨蚊虫标本，将研磨液吸入1.5 ml离心管，4℃，12 000 r/min，离心20 min，取上清感染C6/36、Vero细胞，每隔24 h观察1次，细胞病变“++～+++”时收获，观察7 d。上一代感染上清用于感染下一代细胞 ......
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