人源TNF-α抗体基因的克隆与表达(2)
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参见附件(1950KB，3页)。
1.2.6 Western blotting检测将发现可溶性蛋白的上清按一定浓度梯度进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,先80 V、10 min,再180 V、40 min。用转模仪转模后,将硝酸纤维素模用含有1∶1 200抗人IgG κ链的5%牛奶4℃孵育过夜。将膜用PBST缓冲液洗3次,每次10 min;然后用含1∶1 200二抗的5%牛奶室温孵育1 h,再用PBST缓冲液洗3次,每次10 min,然后用显影液显影。用未克隆入任何基因的空质粒PET22b(+)作阴性对照。
1.2.7人源抗体的抗原特异性结合活性检测将人TNF-α重组蛋白用包被液稀释成不同浓度,96孔板上每孔加60 μl,重复3个孔,用狂犬病毒糖蛋白(Gp)作阴性对照,PBS作空白对照,置湿盒中4℃过夜。加入用PBS稀释的纯化抗体,每孔70 μl,37℃ 1 h。加入HRP标记的抗人IgG κ链二抗,每孔50 μl,37℃ 1 h。A、B液显色,用H2SO4终止反应后,在450 nm波长下测定A值。
2 结果
2.1 VH/K21基因的PCR扩增
以本室已筛选得到的人TNF-α抗体基因VH/K21为模板进行PCR扩增,得到与已知TNF-α抗体基因序列大小一致的基因。见图1。
图1VH/K21的PCR扩增产物(箭头示)
(M:markerⅢ;1～4:VH/K21基因)
Fig. 1PCR products of VH/K21 gene (arrow shown)
(M: markerⅢ;1-4:VH/K21 gene)
2.2 VH/K21基因的克隆与PCR鉴定
将VH/K21的PCR产物与PET22b(+)质粒进行双酶切,连接后转化入E.coli BL21(DE3),挑取单克隆摇菌后进行PCR鉴定,其产物与已知基因序列大小一致。见图2。
图2VH/K21基因克隆与转化后的PCR鉴定结果(箭头示)
(M:markerⅢ;1:阴性结果;2～4:阳性结果)
Fig. 2PCR products of cloning and transformation
of VH/K21 genes (arrow shown)
(M: markerⅢ; 1: negative product; 2-4: positive products)
2.3 VH/K21基因的表达
将PCR鉴定阳性且测序正确的克隆诱导表达后,离心分为上清和沉淀,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,发现大量的可溶性表达蛋白。见图3。
图3 VH/K21基因表达产物电泳图
[M:marker;1:质粒PET22b(+);2:上清;3:沉淀;→:表达蛋白]
Fig. 3Electrophoretogram of expression of VH/K gene
[M: marker; 1: plasmid PET22b(+); 2: supernatant; 3:precipitation;
→:expressed protein]
2.4 Western blotting鉴定
将发现可溶性蛋白的阳性克隆的表达产物,超声离心后取上清按不同浓度梯度进行Western blotting鉴定,用空质粒PET22b(+)作阴性对照。结果显示,该可溶性蛋白可以特异性结合人IgG κ链,表明它是特异针对人的抗体。见图4。
图4含有可溶性蛋白的上清的Western blotting鉴定
[0:质粒PET22b(+);1～4:含不同浓度可溶性蛋白的上清]
Fig. 4Western blotting of supernatant containing soluble protein
[0: plasmid PET22b(+); 1-4: supernatant containing different
concentrations of soluble protein]
2.5 人源抗TNF-α抗体的特异性抗原结合活性检测
将人TNF-α重组蛋白用包被液稀释成不同浓度,包被96孔板,用Gp作阴性对照,PBS作空白对照,ELISA法检测该抗体的特异性抗原结合活性。结果显示,该人源抗体可以特异性地识别人TNF-α,而不能与Gp和BSA结合,表明它是特异针对TNF-α的人源基因工程抗体。见图5。
图5TNF-α抗体的特异性抗原结合活性
Fig. 5Specific binding of anti-TNF-α to antigen
3 讨论
TNF-α是一种促炎症反应细胞因子,在炎症反应和免疫反应的发生和发展中起着关键的作用。研究表明,过敏性鼻炎患者血清中TNF-α水平明显升高[4-5]。而TNF-α基因缺陷[TNF-α(-/-)]的小鼠致敏后其鼻黏膜中嗜酸粒细胞的数量及嗜酸粒细胞活化趋化因子的mRNA表达均较含有TNF-α基因的小鼠[TNF-α+/+(OVA)]明显减少。在TNF-α+/+(OVA)小鼠中存在的卵清蛋白特异性IgE的应答和IL-10 mRNA的表达在TNF-α-/-(OVA)小鼠中完全被消除,而且TNF-α-/-(OVA)小鼠打喷嚏、鼻痒等鼻部症状也明显改善[6],说明TNF-α可能是AR的很好的治疗靶标。2006年我国疾控中心的何杰等将含有可溶性的TNF-α受体和IgG Fc片段(sTNF-α-IgG Fc)的嵌合基因的质粒转移进入上皮细胞中后发现有大量的sTNF-α-IgG Fc融合蛋白表达,该蛋白可以在L929细胞上对抗TNF-α的溶细胞作用 ......
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