高效液相色谱-荧光检测法测定大鼠血小板内5-羟色胺的含量(2)
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2.4 5-HT的测定
取制备好的血小板沉淀,4℃溶解后,加入300 μl纯水悬浮,再加15 μl内标溶液(30 μg/ml α-甲基-5-HT水溶液)、100 μl蛋白沉淀液,混匀,4℃下以11 500×g离心20 min,取上清液20 μl,进样,进行含量测定。
2.5 血小板浓度表示方法
以每109血小板所含的5-HT的量(μg/109 plts)来表示,即大鼠血小板样品测定的5-HT含量除以血小板数。
2.6 色谱条件
采用Waters-510泵;色谱柱:Nucleosil-C18(4 mm×250 mm,10 μm)色谱柱;荧光激发波长:254 nm,发射波长:360 nm,增益:32。流动相:磷酸二氢钾(10 mmol/L,内含EDTA-Na2 0.3 mmol,pH=3.5)∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5,经0.45 μm的滤膜真空抽滤;流速0.5 ml/min;柱温:室温。
2.7 滤光片波长的选择
实验中对5-HT标准水溶液进行全波长荧光扫描,得到5-HT的荧光激发光谱(图1)和发射光谱(图2),可知5-HT的荧光最大激发波长为274 nm,发射波长为348 nm。因此选择254 nm和360 nm的滤镜。
2.8 色谱行为
在上述色谱条件下,标准品及大鼠血小板样品中的5-HT和α-甲基-5-HT均得到良好的分离,5-HT保留时间为7.15 min,内标α-甲基-5-HT为8.42 min,见图3。
2.9 方法学考察
2.9.1 标准曲线的制备精密量取0.25、0.50、1.00、2.00、2.50、4.00 μg/ml浓度的5-HT标准水溶液300 μl,置于玻璃试管中,按“2.4”项下方法处理后,进样,用最小二乘法计算峰面积比Y与浓度X的线性回归方程:Y=1 ......
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