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编号:12124635
川北地区胃癌特异性表达基因的克隆(2)
http://www.100md.com 2011年2月15日 王朝莉 李丽 陈果 杨尚君 敬保迁 任碧轩 冯莉
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    参见附件(3027KB,3页)。

     以稀释后的第二次消减杂交产物为模板,以试剂盒中的引物1进行第一轮抑制性PCR扩增,反应参数为:75℃ 5 min后,94℃ 30sec,以94℃ 30sec、66℃ 30sec、72℃ 1.5 min,27个循环,最后72℃ 6 min。再将稀释后的第一轮PCR产物作为模板,以试剂盒中的巢式PCR引物1和引物2进行第二轮PCR扩增,反应参数为:94℃ 30sec、68℃ 30sec、72℃ 1.5 min,20个循环。以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定质量,并以PCR Purification(Qiagen)纯化PCR产物。

    1.3.4 cDNA消减文库的构建、克隆与测序将上述PCR产物与pGEM-Tasy(Promega)载体连接,转化经CaCl2处理的大肠杆菌JM109,铺于(含X-Gal,IPTG,Amp)LB平板,蓝白斑筛选和快速琼脂糖凝胶电泳方式筛选阳性克隆,随机挑选29个克隆送上海基康生物技术有限公司进行测序,以所测定的DNA序列为基准序列,通过GenBank检索和同源性分析。

    2 结果

    2.1 胃癌组织鉴定

    本实验所用胃癌组织标本和癌旁正常黏膜组织标本均经川北医学院附属医院病理科鉴定证实。

    2.2 总RNA和cDNA的合成

    用Qiagen公司产总RNA快速制备试剂盒提取胃低分化腺癌组织和胃正常黏膜组织的总RNA(图1),用Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech)合成cDNA。结果显示,无论是在胃低分化腺癌组织中还是胃正常黏膜组织中都存在相应基因的大量表达,为构建消减文库奠定基础。

    图1 胃低分化腺癌组织和胃正常黏膜组织总RNA电泳

    (M:λDNA/HindⅢ分子量标准;泳道1:胃癌组织总RNA;泳道2:胃正常黏膜组织总RNA)

    Fig.1 Total RNA electrophoresis of gastric poorly differentiated adenocarcinoma and normal gastric mucous membrance

    (M: λDNA/HindⅢ molecular weight standard; lane1: gastric cancer tissue total RNA; lane2: normal gastric mucous membrance total RNA)

    2.3 胃癌特异表达基因片段的制备

    以RsaⅠ酶切的胃癌cDNA为tester,正常组织cDNA为driver进行SSH和抑制性PCR,产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果显示,在200~800bp范围内的存在一系列基因片段(图2)。

    2.4 胃癌cDNA 消减文库的构建、测序及序列分析

    经过pGEM-T载体连接的序列片段由JM109菌克隆,存在大量的阳性重组子,选取有明显条带的克隆进行序列测定,获得5个特异性序列标签(NBPF1、FAM48A、RXFP2、QDPR和ACTB)。

    3 讨论

    本实验采用SSH对胃低分化腺癌组织和胃正常黏膜组织提取的RNA进行逆向PCR合成cDNA,产物经RsaⅠ酶切后连上接头,进行消减杂交,测序结果获得5个特异性序列标签(NBPF1、FAM48A、RXFP2、ACTB和QDPR)。NBPF1基因(neuroblastoma breakpoint family, member 1):NBPF基因是一种在基因复制过程中出现相互易位产生的融合基因家族,Sherif ZA等[1]报道其与乳腺癌有关,Sossey-Alaoui K等[2]报道其与肾上腺神经节神经母细胞瘤(Ganglioneuroblastoma)有关,Roberts T等[3]报道与恶性成神经细胞瘤有关;RXFP2 基因(relaxin/insulin-like family peptide receptor 2)是松弛素家族肽受体的成员,富含亮氨酸的G蛋白偶联受体,在细胞的代谢过程中能引起cAMP的升高[4],Halls ML等[5]报道其隐睾病和不育症有关;QDPR基因(quinoid dihydropteridine reductase):醌型二氢喋呤还原酶基因,位于4p15.3,在BH4的循环中起关键作用,Farrugia R等[6]报道其突变会导致BH4的循环障碍,导致高苯丙氨酸血症和苯丙酮症的产生,Schochet TL等[7]报道其与青少年的吸烟有一定的关联,Lee PL[8]报道其与哺乳动物饮食中的三价铁离子的还原有一定的关系;FAM48A基因:亦称C13orf19,Kunze D等[9]和Schmidt U等[10]报道其与前列腺癌有关。以上这四种基因与胃癌的发生、发展未见相关的文献报道。ACTB基因(actin beta):细胞骨架蛋白基因,Humar B等[11]报道其与弥散型胃癌有一定的关系。我们将深入研究这些基因的功能及其与胃癌的作用机制。

    本研究采用SSH技术从整体层次对川北地区临床胃低分化腺癌组织和胃黏膜正常组织差异表达基因进行筛选,所筛选到的基因应是与胃癌的发生发展密切相关的基因,观测这些基因在胃癌发生发展中的变化 ......

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