RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(3209KB，3页)。
1.2.3 western-blot法检测mTOR蛋白质表达转染结束后将细胞裂解液加入培养板中提取蛋白质，用BCA法检测蛋白质含量。每例标本取总蛋白60 μg加热至100℃ 10 min，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后用半干式电转印仪转移到PVDF膜上。转膜90 min将膜取出，用蒸馏水冲洗，放入5%脱脂奶粉中，37℃摇床上封闭1 h。再将膜放入mTOR的一抗(兔抗人mTOR单克隆抗体，浓度为中1∶400)中4℃孵育过夜，洗膜后放入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的二抗(1∶2 000)中37℃孵育1 h，洗膜后DAB显色待出现明显条带时，用蒸馏水终止反应。以β-actin(43kD)为内参。凝胶成像系统拍照，获得的图像用软件ImageTool 3.0测灰度值，并与内参相比得其相对值，取3次重复实验结果的均值进行比较。
1.2.4 体外细胞侵袭能力检测取对数生长期细胞，制备成3×105个/ml的单细胞悬液。Transwell小室正反面分别在超净台紫外线照射灭菌2 h，无菌条件下在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜(PVPF膜，孔径8μm)上包被1 mg/ml的Matrigel胶50 μl，37℃放置30 min，使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。在上室的微孔中分别加入上述4组单细胞悬液各100 μl，下室加入含15%FBS的DMEM培养液500 μl作为趋化因子，每组细胞设5个复孔。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h。取出小室，取出Transwell小室，用棉签仔细擦去上室面剩余培养基和未发生转移的细胞，室温干燥30 min。用0.1%结晶紫在37℃条件下染色30 min。光学显微镜下观察侵袭至膜上的细胞数，每个复孔取5个视野进行计数，并取均数进行统计。
1.2.5 体外细胞迁移能力检测将Transwell小室超净台紫外线照射灭菌2 h，在上室的微孔中分别加入4组细胞的单细胞悬液(3×105个/ml)100 μl，随后在下室加入含15%FBS的DMEM培养液500 μl，每组细胞设5个复孔。培养、染色、计数方法同侵袭实验。
1.2.6 统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，组间差异比较采用方差分析方法，两组间进一步比较采用LSD法进行，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 siRNA沉默mTOR基因的效率
蛋白质印迹法检测显示，正常对照组、空白对照组、无义对照组的相对表达强度分别是1.35±0.22、1.34±0.26、1.34±0.19，3组间表达差异无统计学意义(P>0.05)；mTOR siRNA转染组的相对表达强度为0.57±0.13，与各对照组比较均显著降低(P<0.05)。见图1，其中A组为mTOR siRNA转染组，B组为正常对照组、C组为空白对照组、D组为无义对照组。
A组 B组 C组D组
图1 各组HepG2细胞mTOR蛋白质印记法电泳图
Fig.1 mTOR expression in HepG2 cells by western-blot
2.2 体外细胞侵袭能力检测结果
HepG2细胞体外侵袭实验显示，siRNA mTOR转染组的细胞，穿过Transwell小室Matrigel基质胶的细胞数较正常对照组显著减少(P<0.05)，空白对照组、无义对照组与正常对照组比较则无显著性差异(P>0.05)。实验结果提示，RNA干扰沉默mTOR基因能降低肝癌HepG2细胞的侵袭力。见表1。
表1 侵袭实验各组HepG2细胞穿膜细胞数的比较(x±s)
Tab.1 Comparison of transmembrane cell count of HepG2 cell by invasion assay (x±s)
与正常对照组比较，*P<0.05
*P<0.05, vs normal control group
2.3 体外细胞迁移能力检测结果
HepG2细胞体外迁移中，各组透过人工膜的细胞数见表2。siRNA mTOR转染组的细胞数量比正常对照组显著减少(P<0.05)， 这说明RNA干扰沉默mTOR基因能降低肝癌HepG2细胞的迁移力。而空白对照组、无义对照组间与正常对照组比较均差异无统计学意义 (P>0.05)。
表2 迁移实验各组HepG2细胞穿膜细胞数的比较(x±s)
Tab.2 Comparison of transmembrane cell count HepG2 cells in each migration group (x±s)
与正常对照组比较，*P<0.05
*P<0.05, vs normal control group
3 讨论
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是原发性肝癌的高发区。肝癌起病隐匿，发展迅速，恶性程度高，一旦发现多为中晚期，失去了手术机会，而化疗、放疗等姑息性治疗，效果亦不理想。虽然早期患者手术切除是首选的治疗方法，但由于85%~90%的肝癌患者伴有肝硬化，较差的肝功能和肿瘤的多中心性生长，患者也往往不能耐受较大范围的肝脏切除术，并且约有一半的手术患者容易病情复发。侵袭和转移是肝癌难于治疗，导致死亡的主要原因。因此，进一步深入研究肝癌细胞侵袭和转移的相关机制，并在此基础上发展出有效的干预手段，对于提高肝癌患者的治疗水平有重要意义。
近几年来，与肿瘤侵袭和转移相关的基因和蛋白质不断被发现。最近发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)与肿瘤的发生发展有密切关系。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用。mTOR被认为是磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)- related kinase，PIKK)蛋白质家族成员，因为在mTOR的C末端有一个激酶结构域，约234个氨基酸。mTOR可在多种因素的活化下参与基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成、细胞凋亡等多种生物学功能 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(3209KB，3页)。