大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO标记及检测
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1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂、仪器
SD大鼠，体重120～150 g，雌雄不拘，清洁级，由山西医科大学实验动物中心提供。
超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Schering公司，德国)，淋巴细胞分离液、台盼蓝、胰蛋白酶(Sigma公司，美国)，DMEM/L(Hyclone公司，美国)，FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)，VEGF，bFGF(Peprotech公司，英国)，多聚甲醛(天津傲然精细化工研究所)，钙黄绿素(Calcein-AM)、碘化丙啶(PI)(日本同仁化学研究所)，倒置显微镜(Leica公司，德国)，激光共聚焦显微镜(OLYMPUS，日本)，CO2培养箱(SIM公司，美国)。
1.2 细胞的提取、分离与培养
大鼠断颈处死后，置于75%酒精浸泡灭菌5 min。无菌条件下分离肱骨、股骨和胫骨，去除肌肉组织，用注射器吸取PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔，充分冲出骨髓组织后收集至离心管中。将冲洗液沿管壁缓缓加入盛有分离液的离心管内(两者体积比为1∶1)，动作宜轻柔，勿使其与分离液混合，水平离心，2 000 r/min离心30 min，将离心后的白雾状细胞层小心吸出来，用PBS液洗涤3次，应用DMEM/L培养基[含体积分数15%胎牛血清，bFGF和VEGF终浓度均为10 ng/ml，青霉素(100 U/ml)，链霉素(0.1 g/L)]，接种于预铺有纤连蛋白3.5 cm培养皿中，置入在10%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中。72 h后进行第1次半量换液，洗去未贴壁细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态变化，以后根据培养基变化情况每2～3天全量换液。
1.3 EPCS的磁标及观察
SPIO标记细胞，细胞培养8天，加入终浓度25 μg/ml的SPIO，置于培养箱内孵育24 h，用PBS洗涤3次，去除未进入细胞的铁离子。
1.3.1 标记率测定
普鲁士蓝铁染色，细胞爬片后用4%多聚甲醛固定30 min，倒掉后PBS冲洗3次，晾干后加入新鲜Perls溶液(A液：2%亚铁氰化钾；B液：2%盐酸；临用前A、B液等量混合，静置3 min)，置培养箱孵育30 min，PBS冲洗3次，加入0.5%中性红水溶液对比染色10 min，PBS洗涤3次。光镜下观察核呈红色，Fe3+呈蓝色，表明标记成功并计算胞浆内存在蓝色颗粒的细胞数量和比例。
1.3.2 台盼蓝染色检测细胞活力
标记细胞消化离心后制成细胞悬液，取90 μl悬液和10 μl台盼蓝染液混匀，细胞计数板与盖玻片上、下两侧各加10 μl混匀液，镜下观察，计数100个细胞，细胞活力=染色阴性细胞数/100个细胞×100%。未标记组方法同上，倒置显微镜下分别于细胞标记后7 d行细胞活性检测。
1.3.3 MTT法检测细胞增殖力
消化EPCS后接种于96孔板中，每孔体积200 μl，细胞数为1×106 个/ml。标记组和未标记组每组24孔细胞，以纯培养基空白对照，培养1、3、5、7 d后相同时间每组各取6孔细胞，加入20 μl MTT液(5 g/L)孵育4 h后，吸弃孔内培养基，向每孔加入200 μl二甲基亚砜，轻轻振荡10 min充分溶解细胞代谢产物，以空白孔调零后求出各孔吸光度值，用酶标仪检测590 nm吸光度值A 590。
1.3.4 AO/PI染色检测细胞凋亡率
用10 ml PBS溶解AO原粉100 mg制备成1%的AO母液；1 ml ddH2O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/L的PI储备液(1 mg PI/1 ml H2O)(-20℃下避光冷冻保存)。细胞染色前加1ml AO母液和1 ml PI储备液至8 ml PBS中配制成染色溶液。取未标记细胞及标记细胞，各培养皿中加入100 μl染液，37℃温孵10 min后，用PBS洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察，每皿随机取至少3个无重叠视野拍照计数。试验重复3次。AO能透过细胞膜而嵌入双链DNA使之呈现绿色，PI仅能透过破损的细胞膜嵌入DNA使之呈现红色。在激光共聚焦显微镜下观察，细胞凋亡率计算公式：细胞凋亡率=凋亡细胞/(活细胞+凋亡细胞+膜破损细胞)×100%。
1.3.5 Calcein-AM/PI染色检测细胞存活率
用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM制备成1 mmol/L的Calcein-AM储备液；1 ml ddH2O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/L的PI储备液(1 mg PI/1 ml H2O)。细胞染色前加10 μl Calcein-AM储备液和15 μl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。取未标记细胞及标记细胞，用PBS洗涤数次，每皿加入100 μl染色溶液，在37℃下孵育15 min。在激光共聚焦显微镜下观察，先用(490±10) nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。每皿随机取至少3个无重叠视野拍照计数，试验重复3次。
1.4 统计学方法
全部数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理。检测数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EPCS形态学观察
接种初期的EPCS为圆形，体积较小，生长速度较慢。4 d后细胞生长明显加速，大多数细胞呈短梭形，并可见细胞形成集落，7 d后大多数混杂细胞脱落，梭形细胞呈优势生长(图1)。至第10天，梭形细胞继续增多，可见特异性索条状结构或铺路石样排列。
2.2 SPIO标记率测定
标记的EPCS光镜下观察，胞浆内可见棕色铁颗粒浓聚，经普鲁士蓝染色后在光镜下观察，细胞内可见大量蓝染的铁颗粒，在铁浓度为25 μg/ml条件下，细胞形态同未标记细胞无明显差别，大部分细胞的胞浆内可见蓝染颗粒 ......
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