急性分离大鼠皮层神经元的方法与体会(2)
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2 结果
2.1 急性分离的大鼠皮层神经元形态学观察
倒置相差显微镜下，分离完整的神经元表面光洁，有较强的光晕，而且有较长的突起。细胞胞体呈现锥形、椭圆形或三角形，胞质均匀，折光性好；一般有1个顶树突和2个或多个基数突。完整的神经细胞在人工脑脊液中可维持其形状6 h以上(图1)。
2.2 离子通道研究
用锥体细胞作为研究对象，利用前述标准细胞外液，采样参数文件保持电位-80 mV，从-40 mV去极化到+60 mV，共10个阶跃，每个阶跃增加10 mV去极化，脉冲宽度为100~300 ms，刺激频率为1 Hz。全细胞电压钳制条件下记录出的原始电流如图2A，可见电流分内向电流和外向电流，内向电流可被1 μmol/L河豚毒阻断，用CsCl代替电极内液的KCl，则外向电流被1 mmol/L 4-AP和10 mmol/L TEA大部分阻断，向该细胞附近添加TTX和4-AP后，可以记录到延迟整流钾电流IK(图2B)。在细胞外液中添加TTX 和TEA后，可以记录到瞬间外向钾电流IA(图2C)。
A.全细胞电流图形：向下的为钠电流，向上的主要为钾电流，由于向下的钙电流较小，时程与钾电流重叠，因此看不到。B.延迟整流钾电流IK图形：浴液中加入TTX (10 mmol/L)和4-AP(1 mmol/L)后记出的电流，主要为向上的IK。C.瞬间外向钾电流IA图形：浴液中加入TTX (10 mmol/L)和TEA (10 mmol/L)后记出的电流，主要为向上的IA
图2 用全细胞模式记录的急性分离的大鼠皮层神经元电流
3 讨论
3.1 动物的选择
理论上鼠龄越小的大鼠皮层神经元耐受缺氧能力越强，活性越好，分离的效果也越好。鼠龄过大神经元突起较多较长，分离时容易损伤，分离出来的细胞易于封接但破膜比较困难；鼠龄过小神经元未分化成熟，记录出的通道电流较小，且在破膜时负压稍大即可将细胞吸入电极内。根据本实验，选择鼠龄在10~16 d的幼鼠为宜，最佳时间为13 d。
3.2 大鼠皮层神经元的急性分离
膜片钳记录成功的关键是分离完整的、表面光洁的、存活时间较长的锥体细胞。急性分离过程中需要注意的主要关键问题如下：①电极内预先灌注电极内液，为防止电极尖的阻塞，可对电极液进行滤膜过滤。电极内可以给予正压以防止电极尖吸附灰尘和颗粒。②孵育及标准细胞外液pH值，酶浓度及作用时间是影响细胞状态的关键应严格控制。③脑片制备：取材时不要挤压脑组织，以免造成损伤。动作要迅速，脑片制备必须在通氧的冰ACSF中进行，脑片对缺氧敏感，在孵育及酶处理过程中必须连续供给氧气。通气时注意防止脑片随气泡翻动。④消化酶随用随配，防止酶活力下降[5-7]。酶解过程中的酶量与酶解时间要严格控制，酶量增加会导致细胞消化过度，膜片钳记录时间缩短；酶量不足导致细胞消化不够，不易破膜，难以形成全细胞膜片钳记录模式。⑤脑片薄厚切得要适中，过厚不利于氧气透过造成细胞缺氧，过薄则机械性损伤较大。⑥脑片吹打[8]：选择口径大小合适的吹打管，从粗到细依次吹打脑片(口径分别为500、300、150 μm)，效果较好。吸管直径过大或过小，均会造成损伤，不能得到状态良好的神经元。此外，吹打脑片动作要轻柔，否则加重细胞损伤。
本实验分离的大鼠皮层细胞具有明显的突起，细胞膜表面光洁、光晕好。用全细胞膜片钳技术在急性分离的细胞上记录到上述全细胞钠、钾电流，实验结果表明利用该方法急性分离皮层神经元，可用于膜片钳技术探究大脑皮层离子通道及其信号转导机制，为深入了解大脑皮层的功能及其相关疾病发生机制和药物治疗研究奠定基础。
[参考文献]
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[6] 笱玉兰,罗利俊,陈国华,等 ......
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