高效液相色谱-质谱联用法测定人血浆中非索非那定的浓度(2)
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2.3 血浆样品的处理
精密加入血浆样品0.15 ml于离心管中，加入8.56 μg/ml苯乙双胍内标溶液10 μl，振荡10 s，加入乙腈0.4 ml，涡旋2 min，超声5 min，离心10 min(9 500 r/min)。转移上清液，进样10 μl分析。
2.4 色谱行为
在上述条件下，非索非那定出峰时间在12.0 min左右，内标出峰时间在8.7 min左右，非索非那定和内标峰形均良好，无杂峰干扰，基线平稳。提示本方法具有较高的特异性，内源性杂质对药物和内标的测定无干扰，见图1。
A.空白血浆；B.非索非那定对照品溶液(225.46 ng/ml)；C.空白血浆加非索非那定对照品溶液(相当于血浆中含量225.46 ng/ml)；D.受试者单剂量口服120 mg非索非那定制剂后血浆样品的非索非那定色谱图
图1 非索非那定高效液相色谱-质谱联用图谱
2.5 血浆中非索非那定标准曲线及定量下限的测定
取“2.2”项下配制的非索非那定对照品溶液适量，置于一定量的空白血浆中，充分振荡混匀，配制血浆中含非索非那定分别为2.26、4.50、11.00、45.10、90.20、225.46、676.46 ng/ml的标准系列浓度，然后按“2.3”项下方法操作，记录色谱图，记下非索非那定峰和内标峰面积。以非索非那定峰和内标峰面积比值f(f=As/Ai)对血药浓度(C)作回归曲线，得回归方程：f=0.000 830 291C+0.004 045 27(r=0.999 6)。定量下限浓度为2.26 ng/ml，RSD为0.7%。
2.6 准确度与精密度试验
配制含非索非那定低、中、高三个浓度(4.50、45.10、225.46 ng/ml)的质量控制样品，按“2.3”项下操作，每一浓度平行操作5份，代入回归方程计算浓度，以测得值与加入值的比值计算回收率。每一浓度平行操作5份，记录色谱图，记下峰面积，计算其比值并代入相应标准曲线，求得日内精密度。连续3天配制并测定上述浓度样品，考察日间精密度。方法的回收率均在85%～115%之内，日内、日间RSD均小于15%，符合药物动力学研究的方法学要求。见表2。
表2 非索非那定准确度和精密度试验结果
2.7 提取回收率
取空白血浆及非索非那定对照品溶液，配制含非索非那定低、中、高三个浓度(4.5，45.1，225.5 ng/ml)的质量控制样品，按“2.3”项下操作，每一浓度平行操作5份，另取相同量标准品溶液，以水代替血浆，按“2.5”项下操作，作为对照样品，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值来评价提取回收率，结果非索非那定在4.5、45.1、225.5 ng/ml的回收率分别为96.0%、95.2%、101.5%，RSD分别为9.7%、9.7%、2.8%；内标提取回收率为98.6%，RSD为5.1%。
2.8 稳定性试验
取非索非那定对照品溶液适量加入空白血浆中配制相当于含非索非那定低、中、高三个浓度(4.50、45.10、225.46 ng/ml)的质控样品各3份，分别于室温条件下放置0、2、4、8、24 h，4次冷冻(-20℃)-解冻(室温)循环，再于-20℃存放0、10、20、30、40 d，然后按上述方法测定，计算非索非那定的浓度。试验结果显示所有室温放置试验、冰冻和冻融试验的测定值的RSD均小于15%，说明分析测试过程中的样品较为稳定。见表3。
2.9 质量控制试验
受试者血浆样品非索非那定的测定在分析方法证实完成之后进行。在样品测定的同时插入高、中、低浓度的非索非那定质控样品(4.50、45.10、225.46 ng/ml)，根据质控样品的测定结果(准确度)评判该批样品的测定数据是否可被接受。共测试了6批样品，结果质控样品的RSD均在15%之内。
3 讨论
本试验经过摸索，确定了直接用乙腈沉淀去蛋白的LC-MS/MS法测定血浆中非索非那定的含量，所用血样量少，蛋白沉淀率近100%，表明该血样处理方法相对文献报道[6-20]具有操作更简便、重复性好、应用性更强的优势。
采用LC-MS/MS法来测定血浆中非索非那定浓度，非索非那定和内标物苯乙双胍在ESI离子化方式下，主要生成[M+H]+准分子离子峰，选择性地对准分子离子峰[M+H]+进行二级质谱分析，将非索非那定和内标物苯乙双胍生成的主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子，预处理简单，血浆中杂质不干扰样品和内标物的测定，样品稳定性良好，所建立的方法精密度及准确度均能符合药物(化学药品)制剂人体药动学研究的方法学要求。
综上所述，该方法简便、快速、灵敏、精确、特异性强，可用于非索非那定制剂在人体中的药动学和生物等效性分析。
[参考文献]
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[3]Vena GA, Cassano N, Filieri M, et al. Fexofenadine in chronic idiopathic urticaria: a clinical and immunohistochemical evaluation [J] ......
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