氧化苦参碱诱导人胃癌细胞凋亡的实验研究(2)
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1.2 方法
1.2.1 人胃癌裸鼠移植瘤模型的制备 收集对数生长期MGC-803细胞1×107/ml，无菌条件下，裸鼠右腋皮下注射0.2 ml，观察至出现米粒大小结节，模型复制成功。
1.2.2 肿瘤抑制实验 肿瘤生长至100～300 mm3后将动物随机分成5组，分别为阴性对照组[生理盐水(NS)组]、阳性对照组(5-FU组)、氧化苦参碱小剂量组[64 mg/(kg·d)]、氧化苦参碱中剂量组[128 mg/(kg·d)]和氧化苦参碱大剂量组[256 mg/(kg·d)]。每组不少于6只，每天固定时间注射1次，连续观察25 d。
1.2.3 抑瘤效果的评价方法 采用测量瘤径法，动态观察氧化苦参碱的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数为每4天测量1次。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV=1/2×a×b2，其中，a、b分别表示最大长径和最小短径。根据测量结果计算出相对肿瘤体积(RTV)，计算公式为：RTV=Vt/V1，其中，V1为分笼给药时测得的肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤抑制率(IR)，计算公式如下：IR(%)=(1-TRTV/CRTV)×100%，其中，TRTV为治疗组RTV，CRTV为阴性对照组RTV。
1.2.4 裸鼠移植瘤Bcl-2、Bax表达的检测 取部分肿瘤组织制成1×106/ml的单细胞悬液，加入鼠抗人单克隆抗体工作液0.1 ml，室温孵育30 min；加入PBS 10 ml轻洗1次，300～500 g离心5 min；弃上清，加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室温孵育30 min；加入PBS 10 ml轻洗1次，300～500 g离心5 min；弃上清以除去未结合的荧光二抗，加入PBS 0.1 ml，经500目铜网过滤后上机检测，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析。以上机测试的X-mode计算出均道值(蛋白表达量)。公式：均道值=LgX-mode×340。
1.3 统计学分析
应用SPSS 15.0软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 氧化苦参碱对裸鼠移植瘤生长的抑制
见表1。由表1可知，氧化苦参碱能有效抑制肿瘤的生长，且呈一定的量效关系，以中、大剂量组抑瘤作用明显，与阴性对照组比较，差异有高度统计学意义(P<0.01)。
2.2 裸鼠移植瘤细胞Bcl-2、Bax的检测
流式细胞仪定量分析发现，氧化苦参碱组裸鼠移植瘤Bcl-2的表达均降低，其中以中剂量组Bcl-2的表达最低，而大剂量组移植瘤细胞Bcl-2的表达又稍升高，与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。与此相反，移植瘤细胞Bax的表达则升高，且氧化苦参碱中剂量组升高最为明显，高于此剂量的氧化苦参碱并不能更有效地升高Bax的表达。见表2。
3 讨论
本研究结果显示，氧化苦参碱对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤的生长具有良好的抑制作用，且随剂量的增加而增加。氧化苦参碱小、中、大剂量组的平均抑瘤率分别为10.25%、36.50%和43.20%。朱艳琴等[2]的研究表明，苦参素对人胃癌细胞MGC-803具有显著的抑制作用，且具有浓度和时间依赖性，其机制主要与抑制增殖、促进凋亡和直接杀伤三个方面有关。孙宁等[3]从形态学角度阐明氧化苦参碱对人胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤生长具有抑制作用。本实验旨在研究氧化苦参碱诱导人胃癌细胞MGC-803凋亡的分子机制。
在凋亡进程中起调节作用的调控分子中，Bcl-2家族起着决定性作用。Bcl-2和Bax是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白。Bcl-2定位于线粒体外膜、内质网膜和核周膜；Bax正常情况下位于胞质，在凋亡信号诱导后很快迁移到线粒体，呈现高分散的亚细胞定位。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；当Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能[4]。Bcl-2与Bax蛋白的比率决定异源二聚体(Bcl-2/Bax)与同源二聚体(Bax/Bax)的比值，这对决定细胞凋亡的易感性起关键作用。一般而言，Bcl-2的过度表达与Bax形成异源二聚体而阻抑凋亡[5]。
本研究中，经流式细胞仪定量检测，氧化苦参碱3个剂量组裸鼠移植瘤细胞Bcl-2的表达均下降，其中，中、大剂量氧化苦参碱组裸鼠移植瘤Bcl-2的表达与阴性对照组相比，差异有统计学意义；与此相反，裸鼠移植瘤Bax的表达则明显升高，与阴性对照组相比，差异有高度统计学意义，但并无剂量相关性，以氧化苦参碱中剂量组效果最好。
综上所述，氧化苦参碱对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤有一定的抑制作用，且其抑制作用可能是通过下调瘤细胞Bcl-2的表达和上调瘤细胞Bax的表达，从而促进人胃癌细胞MGC-803凋亡实现的。但毕竟接种于裸鼠皮下为异位移植，已脱离了其起源组织器官的微环境。Yamashita[6]证实皮下移植瘤和胃壁原位种植移植瘤对药物的敏感性不同，皮下肿瘤的疗效不等于原位种植的疗效，如要确定氧化苦参碱的体内抗肿瘤作用，需要在胃癌的原位种植移植瘤模型中及在动物胃腺癌模型中进一步研究。
[参考文献]
[1] 司维柯,李鹏,姚捷.苦参碱对HepG2细胞代谢水平和基因水平的影响[J] ......
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