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编号:12150127
刺五加的心肌保护作用及其机制的研究(2)
http://www.100md.com 2011年11月15日 黄伟 李桂霞 解岩 戚汉平
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    参见附件(2506KB,3页)。

     1.3.2 血流动力学测定 结扎6 h后,戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠,分离右侧颈总动脉,插入测压导管,并连接BL-420型多导生理仪,再将导管插入左心室。监测左心室舒张末压、左心室收缩压、左室内压上升(下降)最大速率。

    1.3.3 心肌梗死面积测定 结扎6 h后取出大鼠心脏左室,将心肌均匀横切成5片,放入1%TTC磷酸缓冲液中,37℃水浴,避光染色10 min。心肌颜色白色为缺血区,红色为非缺血区,以缺血区心肌占左室质量比作为梗死面积百分率。

    1.3.4 凋亡指数检测 采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,按照试剂盒步骤操作,缺血心肌阳性细胞以双染确定,以阳性核染细胞数占总细胞核数之比计算凋亡指数。

    1.3.5 细胞内游离钙离子浓度测定[8] 戊巴比妥钠麻醉后快速取出大鼠心脏,用充氧的冷台氏液冲洗,经主动脉接于Langendorff管离体灌流装置上,正常台氏液(NaCl 126 mmol/L,KCl 5.4 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,NaH2PO4 0.33 mmol/L,MgCl2 1.0 mmol/L,CaCl2 1.8 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L,用NaOH调pH为7.4)灌流15 min左右,直至将血液冲洗干净,接着用无钙台氏液继续灌流,最后用含胶原酶Ⅱ(0.2 mg/mL)和BSA(0.2 mg/mL)的无钙台氏液进行循环消化,当心脏变软,将其放入装有5 ml KB液(谷氨酸70 mmol/L,牛磺酸15 mmol/L,KCl 30 mmol/L,KH2PO4 10 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,MgCl2 0.5 mmol/L,葡萄糖10 mmol/L,EGTA 0.5 mmol/L,用KOH调pH为7.4)的试管中,置于4℃冰箱稳定1~2 h备用。取稳定好的细胞用10 μmol/L Fluo-3/AM和0.03% Pluronic F-127在37℃恒温水浴中孵育45 min,然后用正常台氏液洗涤2次去除细胞外Fluo-3/AM。应用激光扫描共聚焦显微镜在氩离子激发波长为488 nm,发射波长为530 nm,物镜(40×)下实时监测细胞内[Ca2+]i浓度的变化,在Time series程序下对细胞XY平面进行扫描,计算细胞XY平面内平均荧光强度(fluorescent intensity,FI),以FI代表细胞内[Ca2+]i浓度,正常细胞[Ca2+]i浓度以F0表示,增加的[Ca2+]i浓度用FI/F0表示。

    1.4 统计学分析

    采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用方差分析,多组间的两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 刺五加对心肌缺血大鼠血流动力学的影响

    与模型组相比,高剂量AS组能显著提高心肌梗死大鼠的左心室收缩压(P<0.05),说明高剂量AS能增强心肌收缩功能,且高剂量AS组左室内压上升(下降)最大速率明显升高(P<0.01),左心室舒张末压降低(P<0.05),说明高剂量AS能增加心肌的舒张功能,提示AS能够改善缺血心肌的心功能。见表1。

    2.2 刺五加对缺血大鼠心肌梗死面积的影响

    与假手术组比较,模型组大鼠心肌梗死面积明显增大(P<0.01)。给予AS后,高剂量AS组大鼠心肌梗死面积与模型组相比明显缩小(P<0.01)。见表2。

    2.3 刺五加对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响

    假手术组仅发现少量心肌细胞凋亡,心肌细胞核呈蓝色,模型组可见大量心肌细胞凋亡,凋亡的心肌细胞核呈深浅不一的棕褐色(图1,见封三)。与模型组比较,高剂量AS组心肌细胞凋亡明显减少(P<0.01),说明AS可以抑制急性心肌缺血大鼠的心肌细胞凋亡(图2,见封三)。

    2.4 刺五加对KCl介导的大鼠心肌细胞[Ca2+]i浓度的影响

    正常细胞[Ca2+]i浓度较低,为绿色;缺血细胞[Ca2+]i浓度较正常细胞升高,为蓝绿色;缺血细胞中加入60 mmol/L KCl,[Ca2+]i浓度显著升高,荧光强度增大;当高剂量AS组细胞加入KCl后,荧光强度值升高,但升高的幅度明显低于缺血+KCl组(图3,见封三)。与正常细胞比较,缺血细胞[Ca2+]i浓度显著增高(P<0.01);与单纯缺血细胞比较,单纯缺血细胞加入KCl后,[Ca2+]i浓度显著增高(P<0.01);与缺血+KCl比较,高剂量AS组细胞加入KCl后,[Ca2+]i浓度显著降低(P<0.01)(图4,见封三)。

    3 讨论

    急性心肌梗死首先会导致心肌细胞的损伤[9],持续的心肌缺血会导致心衰并伴随心律失常,容易引起死亡。急性心肌缺血的治疗核心是保护心肌和降低死亡率。AS被用于治疗脑缺血、冠心病有一定的疗效,而有关其对心肌的保护作用和机制尚未明确。本实验通过建立心肌缺血模型,研究AS的心肌保护作用及可能机制。

    本实验研究结果显示,AS能缩小左冠状动脉前降支结扎大鼠的心肌梗死范围,这是一个最可靠的心肌保护指标,从而说明在大鼠模型中AS有心肌保护作用。AS能提高心肌梗死大鼠的左心室收缩压,升高左室内压上升(下降)最大速率,降低左心室舒张末期压,说明AS具有改善缺血心肌心功能的作用。

    AS对心肌有保护作用,但其对心肌缺血的保护机制尚未明确。缺血能导致细胞凋亡,并引发基因反应[10]。本实验结果显示,AS对心肌缺血所引发的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用,说明AS对缺血心肌的保护作用部分可能是由于减少了心肌细胞的凋亡所引起的 ......

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