非小细胞肺癌患者血清血管内皮生长因子受体2和内皮抑素与临床特征的相关性研究(2)
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1.2 主要试剂和仪器
ES ELISA试剂盒为美国Phoenix公司产品；VEGFR-2 ELISA试剂盒及肿瘤血管酶标试剂CD34为美国R&D公司生产，EGFR ELISA试剂盒为奥地利Bender公司产品，酶标仪为芬兰Thermo公司生产，型号DENLEY GRAGON WELLSCAN MK3。显微镜型号为Olympus BX-51，图像捕捉系统型号为Leica DFC-320。
1.3 标本的收集、保存及制作
全组均于术前抽取外周静脉血5 ml，5 000 r/min离心10 min，分离血清，然后将血清放入2 ml Eppendorf管中，-80℃低温冻存备用。血管密度检测切片由上海交通大学附属第六人民医院病理科制作，肿瘤蜡块常规切片脱蜡后用标准方法CD34免疫组化染色。
1.4 检测方法
ES、VEGFR-2：由上海西唐生物科技有限公司代为检测，严格按试剂盒说明书进行。血管密度：先用低倍显微镜扫视整个玻片寻找CD34染色标记血管密度最高的区域即“热点”后，在高倍显微镜视野下计数被染色的微血管数目，计数血管密度最高的3个区域，计平均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件处理，应用方差分析和Pearson相关性分析，计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 内皮抑素与血管内皮生长因子受体2表达水平之间的相关性
血清ES水平为(20.29±6.10)μg/L，血清VEGFR-2水平为(7.42±4.28)μg/L，ES水平与VEGFR-2水平无明显相关性(r=0.466，P>0.05)，见图1。
2.2 内皮抑素、血管内皮生长因子受体2表达水平与临床特征、病理、分期之间相关性
ES表达水平与肺癌病灶内MVD呈直线负相关关系(r=-0.867，r2=0.752)，直线回归方程为Y=32.002-0.499X(μg/L)(P<0.001)，见图2。VEGFR-2表达水平与肺癌病灶内MVD无相关关系(r=0.372，P>0.05)。
ES表达水平与年龄、吸烟指数、肿瘤直径相关性检验r值分别为0.342、-0.269、0.428，均P>0.05，与性别、病理、分期组间方差分析F值分别为0.254、0.571、0.750，均P>0.05；VEGFR-2表达水平与年龄、吸烟指数、肿瘤直径相关性关系检验r值分别为0.298、0.337、0.413，均P>0.05，与性别、病理、分期组间方差分析F值分别为0.492、0.542、0.381，均P>0.05，各相关数据见表1。
3 讨论
实体肿瘤的发生、生长依赖于新生血管生成，抑制新生血管生成就能抑制其生长[2]。VEGF是最重要的新生血管生成促进因子之一，VEGFR-2是其发挥促血管生成效应因子的主要受体，其在VEGF的信号转导及血管内皮生成中起主导作用[9]。血管内皮抑素是最有效的内源性血管抑制因子[10]。因此，笔者选择ES及VEGFR-2水平作为血管生成和抑制血管的代表，了解NSCLC患者二者之间及其与病理、分期等临床特征的相关性。
尽管大量研究发现ES与VEGFR-2作用相对立，可能互为对方的下调因子[11]，但本研究发现两者并没有相关关系，提示NSCLC患者肿瘤的血管生成是各种血管生成促进因子和抑制因子综合作用的结果，而VEGF与ES仅是肿瘤血管生成中两个最重要的促进因子和抑制因子而已。
本研究发现，ES与肺癌病灶内MVD呈直线负相关关系，即NSCLC患者血中ES表达水平越高，肿瘤内MVD越少，r=-0.867，直线回归方程为Y=32.002-0.499X(μg/L)，P<0.001，r2=0.752，X能够解释Y变异的75.2%，说明术前ES与MVD直线相关性有较好的专业意义，但也提示除了该自变量“MVD”对应变量“术前ES”的影响外，还存在其他的自变量。此结果证明ES是最有效的内源性血管抑制因子之一，同时也提示如果给予外源性ES，人为提高其在NSCLC患者血中水平，很有可能可以减少肿瘤MVD，从而抑制肿瘤生长，为肿瘤治疗指出了新的方向。
由于VEGF与ES在实体肿瘤的发生、发展中有重要作用，能够影响二者在体内水平，就有可能影响肿瘤的发生、发展，笔者试图找出可能影响二者的临床特征，但结果显示，ES、VEGFR-2表达水平与年龄、性别、吸烟指数、病理类型均无明显相关性，提示NSCLC患者体内二者的表达是一个复杂、多因素作用的结果，还需进一步研究。有研究观察到肺癌患者外周血清中VEGF和ES的水平随肺癌临床分期的升级而增高[12-13]，因而认为检测二者水平可以了解肿瘤进展及预后，但本组数据显示，二者与肿瘤最大直径、临床分期均无明显相关性(P>0.05)，而国际TNM临床分期能够很大程度预测预后，因此笔者推断ES、VEGFR-2表达水平与NSCLC患者预后没有明确相关性，也就很难根据此指标来了解预后。分析报道ES、VEGFR-2可以预测预后的文献数据，不难发现，其病例大多是Ⅲ～Ⅳ期患者，而本组均为Ⅰ～Ⅲ期可手术患者，是否因期别明显不同导致二者结果差异，有待深入研究。
虽然VEGF、ES分别作为新生血管生成促进和抑制因子在肺癌发生、发展中起着重要作用，但在本研究结果显示可手术的NSCLC患者中二者并无明显相关性，其与临床特征之间也无明确的相关性，VEGFR-2、ES可能无法单独作为NSCLC患者分期及预后判断的有效指标，ES与肺癌病灶内MVD呈直线负相关关系，提示抑制血管生成治疗可能是NSCLC治疗的一个有效方法 ......
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