八角茴香油的提取工艺及抗菌、抗氧化性作用(2)
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参见附件(2493KB，3页)。
2.1.5 八角茴香油提取率 八角茴香油提取率(%)＝八角茴香油重量/八角粉重量×100%。
2.1.6 试验与结果 根据表1 选用L9(34)正交试验表研究提取工艺参数，试验设计与结果见表2，方差分析见表3。
2.2 抑菌实验
2.2.1 抑菌试液的制备 以95%乙醇倍比稀释，取“2.1.3项”下提取的八角茴香油配制成含生药100%(即1 ml含1 g)的抑菌试液50 ml；另取倍比稀释用的95%乙醇50 ml作抑菌对照试剂，备用。
2.2.2 菌悬液的制 配制牛肉膏蛋白胨培养基，转接金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、黑曲霉菌和酵母菌至试管斜面，25℃培养24 h活化，用灭菌注射用水洗下菌苔制成菌苔菌悬液，制成菌悬液，细菌使用平板计数法，霉菌、酵母菌使用显微镜直接记数法测菌体个数， 调至浓度为含菌体为1.5×108 cfu/L的菌悬液，备用。
2.2.3 抑菌滤纸片的制备 选择吸水性强的滤纸，烘干，用打孔器制成若干直径为6 mm的圆形纸片，高压灭菌。在经高压灭菌干燥后的培养皿中倒入抑菌试液30 ml，用镊子将滤纸片夹入浸泡12 h后后置于经干燥灭菌的培养皿中，备用。
2.2.4 抑菌圈的测定[5] 取制备好的抑菌滤纸片贴在含菌平板上， 每皿贴3片。细菌置培养箱37℃培养24 h， 酵母菌置培养箱28℃培养48 h， 霉菌置培养箱28℃培养1周。选取抑菌圈比较明显的平板测定抑菌圈直径，取3贴测定的抑菌圈直径的平均值。95%乙醇作抑菌对照，同时设立灭菌注射用水阴性对照。结果：大肠埃希菌的抑菌圈直径是14.21 mm， 金黄色葡萄球菌是15.32 mm，酵母菌的抑菌圈直径是15.01 mm，黑曲霉菌的抑菌圈直径是11.10 mm。
2.2.5 最低抑菌浓度(MIC)试验 采用两倍稀释法；分别取经高压灭菌试管8 支，将抑菌试液1 ml 以灭菌注射用水倍比稀释成0.5、0.25、 0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 g/ml。第7号管作为不加抑菌试液的对照管，第8号管只加抑菌试液1 ml作为不加菌悬液的对照管。在每个试管中加入9 ml 琼脂培养基，充分混匀，待完全凝固后用加样器接种1 ml菌悬液， 细菌置培养箱中37℃培养24 h，酵母置培养箱中28℃培养48 h，霉菌置培养箱中28℃培养1周。以肉眼观察，以药物最低浓度管无细菌生长者为受试菌的MIC值(mg/L)， 所有试验均在不同日期重复3遍。结果：大肠埃希菌MIC是31.25，金黄色葡萄球菌MIC是15.625，酵母菌MIC是62.5，黑曲霉菌MIC是62.5。
2.2.6 抑菌圈的判定标准[6] 抑菌圈直径>15 mm 为最敏感，10～15 mm 为中度敏感，7～9 mm时为低度敏感，无抑菌者为不敏感。
2.2.7 结果 八角茴香油浓度在15.62~62.50 mg/ml时对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌及黑曲霉菌等呈中度敏感，具有抗菌活性。
2.3 清除DPPH-自由基能力的测定[7]
精密称取DPPH·10 mg溶于100 ml无水乙醇， 得储备液，冰箱避光保存。用时稀释4倍得6.5×10-5 mol/L DPPH·溶液，按“表4”加样，反应30 min后1 cm比色皿517 nm下测定吸光值。重复测定3次，结果取平均值。另将八角茴香油(待测抗氧化剂)用蒸馏水和70%乙醇分别配制成浓度0.03%、0.06%、0.09%、0.12%的系列溶液，分别按“表4”加样，反应30 min 后分别依次在517 nm下测定吸光值(n=3)，取3次测定值的平均值分别计算清除率(%)，所对应的清除率分别为23.15%、44.23%、60.12%、70.14%。
清除率(%)= [1-(Ai-Aj)/Ao]×100%。
表4 DPPH实验加样量
3 讨论
3.1 对表2进行数据处理
由直观分析和方差分析可知，以八角茴香油取油量为评价指标 ，最佳提取工艺条件为 A2B2C3，各因素的主次顺序为C>B>A，但方差分析表明各因素对八角茴香油提取的量均无显著影响(表3)。基于以上分析，可确定本方案提取八角茴香油工艺的最佳条件为A2B2C3，即加乙醇倍量为 6倍，虹吸次数为6次，浸泡时间为2.4 h。采用乙醇回流提取八角茴香油，提取出的有效成分较多，溶剂对环境和人体都安全而且用量较少，提取时间短；但优选乙醇浓度对八角茴香油提取效率的影响还需要进一步的探索；同时提取物在制备、储存时存在提取物易挥发损失。剂量不易控制、稳定性差等缺点，要实际应用于规模化生产还需要有相关的技术来解决。
3.2 八角茴香油对供试菌的抑菌分析
实验显示，八角茴香油对金黄色葡萄球菌、酵母菌的抑菌直径>15 mm， 属最敏感，对大肠埃希菌、霉菌的抑制属中度敏感，这表明八角对细菌和真菌均有很强的抑制作用。提取物对液菌种的MIC值表明八角对酵母菌、霉菌的抑菌浓度>6.3%，大肠埃希菌>3.1%，对金黄色葡萄球菌>1.6%与提取物抑菌试验结果相吻合。对细菌的抑制作用较强，对真菌也有一定的抑制作用，但相对较弱，可见八角对各种菌都有比较强的抑制作用，它是一种天然的广谱抗菌药。当然对在试验中采用八角茴香的醇提取液进行室内生化检测试验，对某些含量较少但又有抑菌活性的物质有可能难以表现出活性，应该采用活性追踪的方法对粗提液进行进一步的分离、纯化以寻找或确定其主要或有效抑菌活性成分。对抗菌剂而言，离体条件下无效的提取液有可能会在活体上表现活性，因此，有必要对八角茴香的乙醇提取物进行活体抑菌试验，以便于进一步研究。八角茴香的乙醇提取物的抗菌谱、作用方式、作用机制有待于进一步研究。
3.3 八角茴香油的抗氧化作用
试验结果表明，八角茴香的乙醇提取物对DPPH-自由基有明显的清除作用，在试验区间，随着浓度的增加，其对DPPH-自由基的清除能力也增强。关于DPPH·法检测抗氧化活性相对于抗氧化能力的体内测定方法而言，这种体外测定方法时间短，所需的经费较少，所需用的仪器设备较简单，在国内外有着广泛的应用；但是在试验过程中存在一些条件选择的差异，如初始浓度、反应时间等[8-9]。
志谢：承蒙主任中医师傅旭东对八角进行鉴定，谨此致谢。
[参考文献]
[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第三十卷第一分册)[M].北京:科学出版社,1996:228.
[2] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2010:4.
[3] 赵俊丽,骆志成,武三卯,等 ......
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