孕酮对视网膜缺血再灌注损伤神经元凋亡的影响(2)
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1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
选择新西兰大白兔36只，由重庆医科大学实验动物中心提供，体重2.0~2.5 kg；随机分为正常组4只，孕酮组和对照组，各16只，孕酮组和对照组再依不同再灌注时间，各按造模后12、24、48、72 h分为四组，各组4只。
1.2 试剂与仪器
试剂：孕酮注射液、速眠新(长春军需大学兽医研究所提供)，链霉卵白素—过氧化物酶(HistostainTM-SP)免疫组化试剂盒、TUNEL试剂盒(ROCHE公司提供)，兔多抗Bcl-2 IgG (武汉Boster公司提供)。仪器：GD-8型多媒体彩色图像病理分析仪。
1.3 模型建立
采用常规饲养新西兰大白兔。对照组和孕酮组分别在缺血前24 h肌内注射4 ml/kg生理盐水和4 mg/kg孕酮，1%地卡因滴眼局部麻醉，并给予速眠新0.3 ml/kg耳缘静脉注射。麻醉成功后将大白兔置于兔架固定器上固定，将连接生理盐水瓶输液管的4号半针自大白兔角膜缘穿入前房固定，升高输液瓶至与眼球垂直距离150 cm处(14.63 kPa眼内压)，使网膜血管断流，可见球结膜苍白外观，维持1 h，遂将输液瓶高度渐放低，至兔眼球水平，恢复视网膜血供。
1.4 标本制作
给予0.3 ml/kg速眠新耳缘静脉注射麻醉动物，摘除眼球并编号。眼球于4%多聚甲醛固定6 h，只保留眼球视网膜，放入10%和20%蔗糖溶液内各2 h，30%蔗糖溶液内过夜；OCT包埋剂填充眼球，沿矢状面作连续5 μm切片；HE染色并于光镜下观察对照组和孕酮组视网膜细胞在不同时间点的形态变化，测量从内界膜到内核层间的长度。
1.5 免疫组化法检测Bcl-2蛋白表达
采用0.3% H2O2室温处理切片10 min，蒸馏水洗3次，浸入pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中，加热达98℃断电，95~98℃ 处理30 min，冷却后滴加山羊血清封闭液，处理20 min，加Bcl-2 多克隆抗体，4℃过夜，PBS洗3次，加入生物素化羊抗兔IgG，37℃处理90 min，PBS洗3次，加试剂S-A/RP，37℃处理30 min，PBS洗5次，DAB显色10 min后脱水、透明、封片。
1.6 凋亡检测
采用新制备的4%多聚甲醛溶液室温下固定切片30 min，PBS洗片，放入0.3%H2O2溶液中恒温处理10 min，PBS洗3次；将其置于新配制的4℃ 0.1% Triton X-100及0.1% 枸橼酸钠缓冲液中各处理5 min，PBS洗3次；加TUNEL混合反应液，37℃处理60 min，PBS洗3次；滴加Converter-POD，37℃处理30 min，PBS洗6次，每次洗5 min；DAB显色15 min，中性树胶封片。阳性对照组于反应体系前用DNA酶Ⅰ消化，阴性对照组不加末端核糖核酸转移酶。
1.7 观察指标
于光镜10×40视野下进行结果观察，每只眼球取4张片观察，每张切片取4个视野。HE染色：测量从内核层到内界膜间的长度，并计数内核层每100 μm长视野内的细胞数；计量每100 μm长视野内表达Bcl-2和凋亡阳性细胞数。
1.8 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 视网膜组织学情况
光镜下观察，孕酮组视网膜内层厚度厚于对照组，两组比较各时间段差异均有统计学意义(P<0.05)。孕酮组视网膜内核层细胞数多于对照组，且细胞排列较规整，两组比较各时间段差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 孕酮组与对照组不同再灌注时间视网膜内层厚度
及内核层细胞数比较(x±s)
注：与对照组比较，*P<0.05
2.2 Bcl-2蛋白表达情况
正常组视网膜Bcl-2染色阴性。孕酮组缺血再灌注24 h后可见Bcl-2阳性表达，阳性细胞数为(11.47±1.53)/100 μm；对照组缺血再灌注24 h在视网膜节细胞层可见阳性着染，阳性细胞数为(7.06±1.15)/100 μm，两组差异有统计学意义 (P<0.05)。
2.3 细胞凋亡情况
正常组视网膜TUNEL染色阴性，无凋亡。对照组缺血再灌注12 h，视网膜节细胞层和内核层可见凋亡细胞，缺血再灌注24 h凋亡达到峰值，且凋亡细胞主要见于视网膜内核层，而视网膜外核层凋亡细胞表达不明显，24 h后凋亡细胞数量逐渐下降，缺血再灌注48 h时凋亡征象已明显减弱。计数凋亡高峰期(缺血再灌注24 h)孕酮组和对照组视网膜内核层阳性细胞数分别为(4.03±0.55)/100 μm和(9.45±1.63)/100 μm，两组差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
视网膜急性缺血性疾病临床常见，如闭角型青光眼急性发作期、视网膜中央动脉阻塞等，目前主要治疗措施是恢复视网膜血液循环。但视网膜血液再通后会出现视力下降甚至出现不可逆的视力损害，其损伤的病理生理机制十分复杂，是目前国内外研究的难点之一。本实验所采用的提高眼压方法制作视网膜缺血模型，已被许多实验研究证实可行[1-2]。
本实验研究结果显示，用TUNEL法原位标记凋亡细胞主要位于视网膜节细胞层和内核层，直观地证明了缺血再灌注损伤的视网膜存在神经元凋亡现象。Niu等[3]研究证明，凋亡是视网膜缺血再灌注损伤后神经节细胞死亡的重要方式，电子显微镜观察发现，在视网膜不同类型的细胞死亡中，凋亡是主要形式之一。有研究认为，神经缺血再灌损伤由微血管的损伤和炎症、钙超载、一氧化氮合酶、NF-κB及其诱导的因子及氧自由基等多种因素引起。Wang等[4]研究证实，视网膜缺血再灌注损伤中凋亡是神经元丢失的重要因素之一，细胞凋亡受多种相关基因调控如Bax、Caspase、Bcl-xl、Bcl-2等。本实验研究结果发现，孕酮组神经元凋亡数目均少于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)。说明孕酮可减轻神经损伤，减少缺血-再灌注后细胞凋亡，该结果与既往研究相符[5-6]。多种因素在缺血、缺氧时调节细胞的生存与死亡 ......
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