多药耐药基因作用的新发现(2)
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[Key words] Cell line; Small cell lung cancer; Radiation; MDR1 mRNA; Chemosensitivity; Mitomycin C; Reversal effect; Verapamil; Radio-sensitivity
在临床上使用一种化疗药对肿瘤患者实施化疗后，治疗后的肿瘤细胞可同时对多种不同结构的其他抗癌药也产生耐药性，这种现象称为多药耐药(multi-drug resistance，MDR)。人类肿瘤细胞多药耐药的经典途径是由多药耐药基因(MDR1 Gene)转录出MDR1 mRNA，再由MDR1 mRNA翻译的糖蛋白(P-gp)介导的[1]。这种ATP酶依赖的跨膜蛋白P-gp，有将天然来源的药物泵出细胞的功能，这可使细胞内的药物浓度降低而导致MDR[2]。临床上有时患者在外照射后对其后的化疗不再敏感，即外照射也表现出了MDR表型。本文主要是观察被照射的小细胞肺癌细胞系在外照射前后其总RNA、MDR1 mRNA、药物敏感性以及放射敏感性的变化，从而探讨多药耐药基因是否还有其他未被揭示的新作用。
1 材料与方法
1.1 材料
上海科学院细胞库购得NCI-H446小细胞肺癌细胞系。该细胞系的生物学性状参见文献[3]，其培养条件参见文献[4]。细胞生长进入指数期后进行实验。
1.2 方法
1.2.1 照射条件 采用中国核动力研究设计院实验工厂生产的GWGP80型远距离60Co治疗机，照射条件参见文献[4]。
1.2.2 细胞的外照射 当NCI-H446细胞进入指数生长期后，用0.25%胰酶消化，并将吹匀的细胞悬液移入75 ml的细胞培养瓶中进行培养，等细胞贴壁并汇合后进行外照射，照射剂量为2 Gy/次(戈瑞，辐射吸收剂量单位)，中间恢复3 d，总的外照射剂量为50 Gy[5]。
1.2.3 外照射前后NCI-H446细胞总RNA的提取 分别取照射前后的NCI-H446细胞约1×107个，用PBS将NCI-H446细胞冲洗2遍，离心后弃上清液，各加1 ml Gibco公司生产的Trizol，吹打使NCI-H446细胞溶解，用氯仿液抽提后，加入异丙醇沉淀，用70%乙醇洗涤，然后凉干，最后加0.1%DEPC水溶解总RNA。提取后的总RNA经紫外分光光度计260 nm定量。
1.2.4 RT-PCR RT-PCR的详细过程参见参考文献[4]。
1.3 不同浓度的丝裂霉素(MMC)对外照射前后两组细胞存活率的影响
1.3.1 配制不同血浆峰浓度(PPC)的MMC 配制不同血浆峰浓度(PPC)的MMC的具体方法参见参考文献[6]。丝裂霉素的血浆峰浓度为0.5 μg/ml[7]。
1.3.2 制备外照射前后两组细胞相同浓度的单细胞悬液 具体方法参见参考文献[6]。
1.3.3 细胞毒性试验 具体方法参见参考文献[6]。
1.3.4 不同浓度丝裂霉素作用下两组细胞的平均存活率 细胞存活率的计算公式[8]如下：
细胞的平均存活率是每组6个样本的细胞存活率的平均数，数据以均数±标准差(x±s)表示。在相同的条件下细胞的存活率高，提示相对耐药；反之，则相对敏感。
1.4 加逆转剂维拉帕米后不同浓度丝裂霉素(MMC)对外照射前后两组细胞存活率的影响
1.4.1 配制不同血浆峰浓度(PPC)的MMC 方法同本文的“1.3.1”，但不用生理盐水稀释，而用细胞培养液1640溶解。
1.4.2 逆转剂维拉帕米的配制 取12.45 ml的1640培养液加50 μl的5 mg/ml的维拉帕米即可制成浓度为20 μg/ml的维拉帕米溶液[9]。
1.4.3 制备外照射前后两组细胞的单细胞悬液 方法同本文的“1.3.2”。
1.4.4 细胞耐药性的逆转实验 具体方法参见参考文献[6]。
1.4.5 计算不同浓度丝裂霉素作用下和加入逆转剂维拉帕米后两组细胞的平均存活率 见“1.3.4”所述。
1.5 外照射前后NCI-H446细胞放射敏感性的变化
1.5.1 外照射前后NCI-H446细胞存活率(S)的变化 实验分Sc组和Rc组，每组各取3.5 cm的细胞培养皿18个。每个培养皿加入细胞300个，再加入1640应用液1.5~2.0 ml，每组细胞的18个培养皿再分成6小组，每组3个皿。分别给予0、2、4、6、8和10 Gy 6个不同剂量的外照射。1周后计算两组细胞的集落形成率(PE)和每小组细胞的存活率(S)，并比较两组细胞的PE和在相同剂量外照射条件下的存活率。同时取原本细胞组的存活率最接近50%的外照射剂量作为下一步实验的外照射剂量。PE和S的计算公式如下：
1.5.2 两组细胞生长状况和细胞死亡率的差别[10-11] 取Sc和Rc各5组，每组3个培养皿，每个皿中加入指数生长期细胞1×104个，培养2~3 d，使其贴壁并进入指数生长期，按步骤“1.5.1”确定的2 Gy放射剂量作为测试两组细胞放射敏感性的外照射剂量。使用这个外照射剂量同时一次性照射两组共30个培养皿的细胞。照射后分别于第2、4、6、8和10天各取1组共6个皿进行细胞计数，取每组3个皿细胞的平均数作为最后结果。每次将做完细胞计数的剩余单细胞悬液加入离心管，以1 500 r/min的转速离心5 min，然后弃上清液，加入0.5%台酚蓝2~3滴将细胞染色，染色后的细胞点滴在血球计数板上，分别计数活细胞(白色)和死亡细胞(蓝色)，算出细胞死亡率(P)。细胞死亡率的计算公式如下：
1.6 统计学方法 ......
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