E.coliDH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究(2)
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1.2.5 phoAm基因的诱导表达 分别接种pET28a-phoAm/BL21(DE3)和pET28a/BL21(DE3)单菌落至5 ml LB培养液中，37℃振荡培养过夜。按1%的比例接种阳性菌液至100 ml LB培养液中，37℃振荡培养，至菌液OD600 nm约为0.4时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养3 h。
1.2.6 重组蛋白(rAKP)的检测 菌体离心后，加入缓冲液超声破碎，离心取上清液，用免疫金层析法检测6×His标签，用SDS-PAGE法检测表达蛋白。
1.2.7 重组蛋白(rAKP)的纯化 采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。对洗脱液进行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。
1.2.8 重组蛋白(rAKP)的活性分析 采用对硝基酚磷酸(pNPP)法测定rAKP的活性。取发酵菌体超声破碎后的上清液，加入测活液，30℃反应10 min，加入终止液终止反应，于波长410 nm处测吸收值。
2 结果
2.1 PCR扩增E.coli DH10B成熟肽基因(phoA)
PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上分析，可见1.4 kb的条带(图1)大小与预期一致。
1.DNA Marker；2.PCR产物
图1 E.coli DH10B phoAm PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
2.2 重组蛋白(rAKP)的表达与检测
重组菌诱导表达后，取超声破碎后的上清液，分别用免疫金层析法快速检测6×His标签(图2)，用SDS-PAGE法检测表达蛋白(图3)。rAKP的分子量约为47 K。
1：阴性对照；2：rAKP(含6×His标签)
图2 免疫金层析法快速检测His标签蛋白
从左至右分别为诱导0、2、4 h；第4泳道为蛋白质分子量Marker
图3 SDS-PAGE检测诱导表达的rAKP
2.3 重组蛋白(rAKP)的活性分析
rAKP经活性分析，对照菌E.coli BL21(DE3)的OD405 nm为0.120，重组菌E.coli BL21(DE3)/phoAm的OD405 nm为2.58，即重组菌的碱性磷酸酶活性提高21.5倍。
3 讨论
本研究首次从E.coli DH10B菌株的基因组中克隆了碱性磷酸酶成熟肽基因，并进行了表达、纯化与活性研究。E.coli AKP作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。目前市场上常见的AKP产品有虾碱性磷酸酶(SAP)和牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)，其中CIAP的活性最高，约为天然E.coli AKP的40倍[3]。与天然提纯的SAP和CIAP相比，E.coli AKP的生产成本低，热稳定性好。由于AKP的构效关系明确，且在定点诱变和结构改造方面积累了一定的经验[4-5]。进一步研究可结合计算机模拟对E.coli AKP的三维结构与催化活性之间的关系进行深入分析[6]，利用当前蛋白质工程的先进技术手段对重组E.coli AKP进一步改构。
[参考文献]
[1] Coleman JE, Gettins P. Alkaline phosphatase, solution structure, and mechanism [J]. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1983,55:381-452 ......
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