不同炮制方法对黄连主成分含量及抗菌活性的影响(2)
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参见附件。
2.1.3.2 精密度试验 分别精密吸取同一对照品溶液1 μl，连续进样5次，求得盐酸小檗碱对照品峰面积的RSD＝6.2%。另外，于同一天不同时间分别进样测定，求得日内RSD=4.56%(n=5)；于不同的5 d同一时间连续测定求得日间含量RSD=1.68%(n=5)，表明仪器精密度良好。
2.1.3.3 稳定性试验 按照“2.1.2.2”项下方法操作，考察同一供试品溶液放置0、2、5、10、24 h后盐酸小檗碱含量的变化，结果显示，其含量RSD=0.51%，表明溶液在24 h内稳定性良好。
2.1.3.4 重复性试验 按照“2.1.2.2”项下方法操作，对同一样品依法测定6次，进样测定盐酸小檗碱的含量，结果RSD＝1.18%，表明本法重复性良好。
2.1.3.5 加样回收率试验 精密移取盐酸小檗碱对照品溶液，加甲醇制成5.38 mg/ml对照品溶液，分别精密吸取上述溶液0.8、1.0、1.2 ml，按低、中、高3个量级溶液，定容，过滤，同一量级平行操作2份，计算回收率，结果盐酸小檗碱的平均加样回收率为98.6%，RSD=1.2%(n=5)。
2.2 黄连不同炮制品的制备
2.2.1 生黄连
取黄连原药材(成簇者掰开)，除去泥沙等杂质，抢水洗净略润，切薄片，阴凉处干燥。
2.2.2 酒黄连
取黄连片100 g，加入黄酒12.5 g拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，用文火加热，炒至表面色变深时，取出，摊凉，筛去碎屑。
2.2.3 萸黄连
取吴茱萸10 g，加适量水煎煮，取汁去渣，煎液与净黄连100 g拌匀，稍闷润，待药液被吸尽后，用文火加热，炒干，取出，摊凉，筛去碎屑。
2.2.4 姜黄连
取黄连片100 g，用生姜12.5 g或干姜4 g，绞汁或煎汁，取姜汁拌匀，稍闷润，待姜汁被吸尽后，用文火加热炒，炒至表面色变深时，取出，摊凉，筛去碎屑。
2.3 供试品溶液的制备
分别称取生黄连和3种黄连炮制品20 g，经粉碎成粗粉备用。称取粗粉10 g，加纯化水100 ml浸泡0.5 h，先以武火加热，直至煮沸，改以文火加热，继续再煎煮0.5 h。煎煮液以4层纱布过滤，收集滤液备用。滤渣加纯化水100 ml，重复加热、煎煮提取0.5 h，并过滤，收集滤液。合并2次滤液，水浴浓缩，直至浓缩至20 ml，收集生黄连和3种黄连炮制品浓缩液，相当于含生药0.5 g/ml。精密移取4种浓缩液各2.5 ml，分别加入95%乙醇7.5 ml，搅拌均匀，静置12 h，倾取药液上层液，得水提醇沉液，取适量20 000 r/min高速离心20 min。取离心液上层清液，将上清液稀释100倍，相当含生药1.25 mg/ml，制得样品溶液，备用。
2.4 黄连不同炮制品水煎剂中小檗碱的含量测定
分别精密吸取生黄连和3种黄连炮制品样品溶液各10 μl注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，计算样品溶液中盐酸小檗碱含量，测定结果见表1。结果显示各样品中小檗碱含量排序为：姜黄连>酒黄连>萸黄连>生黄连，其中姜黄连、酒黄连中盐酸小檗碱的含量明显高于萸黄连，而生黄连的含量则最低。
表1 黄连生品及其不同炮制品中盐酸小檗碱含量测定结果(mg)
2.5 黄连不同炮制品水煎剂的抑菌实验
培养基按配方比例煮沸溶解于蒸馏水中，调pH值后，在121℃高压灭菌15 min，冷却到45~50℃后以无菌方式分装备用。采用混合法进行，将各炮制品水煎液的原液，分别用无菌蒸馏水作等倍稀释(1/2~1/32)，加入双倍营养琼脂混合，倾注成平板。将活化后的菌种接种于固体培养基上， 分别挑选菌龄12~16 h、浓度80万/ml的实验菌液接种，在箱培养37℃温度下培养。恒温培养24 h，显微镜观察各细菌在不同药物浓度中生长情况，如果观察到不生长的药物时的浓度，即记录为该药液的最低抑菌浓度(MIC)。黄连不同炮制品的抑菌作用，以该药物的最低抑菌浓度来衡量其对常见细菌的体外抑菌效果。见表2。
表2 黄连及其不同炮制品对不同菌株的最低抑菌浓度(g/ml)
由表2可知，不同炮制品中酒黄连平均MIC最低，为0.23 g/ml，生黄连最高，为0.40 g/ml。抗菌实验结果表明，生黄连及其不同炮制品对不同细菌显示了不同的抗菌特性。提示，黄连不同炮制品的水煎液对上述各菌株均有不同程度的抑制作用。
3 讨论
黄连及其炮制品中生物碱类化学成分复杂，在研究过程中，笔者考察了流动相的pH、流速的变化、柱温的变化及样品不同制备方法、溶剂用量、不同提取时间。根据上述试验结果，确定了本研究中样品处理条件及色谱条件。本法简便易行、准确灵敏，重复性好，使用范围广，可用于检验、评价生黄连及其不同炮制品。
实验结果表明黄连经炮制后，其总生物碱的含量以盐酸小檗碱计，由强及弱的顺序为：姜黄连>酒黄连>萸黄连>生黄连。但从总体来说，各类型炮制品中盐酸小檗碱含量要大于生品，因此炮制对黄连中主要成分的含量有一定的影响。
黄连为大苦大寒之品，服用日久易败胃，临床中治疗痈疽肿毒常用生品，而治疗痢疾和腹泻则常用其炮制品，以防止其寒性太过。黄连中主要有效成分为小檗碱，其具有较强的抑菌作用。实验结果显示，不同炮制品和生品相比也都有一定程度的抑菌作用，但炮制品的抗菌作用稍强。本实验欲探讨黄酒、吴茱萸和生姜对黄连抗菌作用机制的影响，实验结果证明黄连炮制后具有明显的抑菌作用，不同炮制方法对黄连的抗菌作用产生了较大的影响，经炮制后黄连不但抑菌活性有不同程度的增强，且减弱其对肠胃道的不良作用，本研究为临床应用提供了科学依据 ......
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