Bcl-2、CytC和caspase-3在实验性精索静脉曲张大鼠生精细胞中的表达及意义(2)
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参见附件。
1.3.3 TUNEL 切取5 μm厚睾丸组织石蜡切片，实验步骤严格按北京中山金桥公司提供的试剂盒说明书检测细胞凋亡，细胞核染成棕色者为TUNEL阳性细胞，光镜下(×400)每张切片选取10个视野，计数500个细胞，计算生精细胞中的凋亡细胞所占百分率，作为生精细胞的凋亡指数(AI)。
1.4 统计学方法
应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间的比较采用方差分析，两两间的比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色
对照组睾丸生精上皮完整，各级生精细胞及精子排列有序。ELV 2周组无明显变化。ELV 4周组睾丸生精细胞上皮变薄，不完整，曲细精管管腔增大，精子明显减少，各级生精细胞减少，并可见一些细胞的染色质边集化，呈环状。ELV 8周组生精上皮基膜破裂，一些曲细精管中出现“多核巨细胞”(multinucleated giant cells)，即多个细胞核聚集形成一个大的细胞团块，其中一些细胞核染色质明显边集化，呈环状，间质细胞水肿增大。
2.2 免疫组化
Bcl-2、CytC和caspase-3蛋白在实验组和对照组的各级生精细胞细胞质和细胞核中均可见到表达，阳性结果均为棕黄色物质分布。两组的平均灰度值见表1。
表1 实验组、对照组免疫组化平均灰度值(x±s)
注：与对照组相同时间段比较，◆P ﹤0.05；与本组2周时比较，▲P ﹤0.05；与本组4周时比较，★P ﹤0.05
2.3 TUNEL法检测凋亡
对照组中可见少量细胞凋亡细胞，主要集中在次级精母细胞及分裂期的精子细胞。2周实验组可见极少量生精细胞细胞凋亡；4周实验组可见曲细精小管中各级生精细胞较对照组及2周实验组凋亡增加；8周实验组可见曲细精小管中各级生精细胞大量凋亡，管腔变薄，管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。见表2。
3 讨论
细胞凋亡又叫程序性细胞死亡，是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的，其具体的过程机制尚不明确，Bcl-2是一种细胞膜蛋白，主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上[2]，高水平的Bcl-2蛋白有抑制细胞死亡等作用，是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白[3]。Tanaka等[4]证实Bcl-2能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。CytC是一个线粒体起源的细胞凋亡信号，Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质，而Bax、Bak可与Bcl-2结合，阻止其对CytC释放孔道的抑制作用，从而促进CytC从线粒体释放，引起凋亡[5]。CytC通过接头分子使caspase(胱冬肽酶)分子募集并相互酶解活化，进而诱导细胞凋亡。caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下，caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中，无活性，当细胞接受凋亡刺激时，其被激活，而诱导凋亡[6]。caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[7]。
本实验发现，ELV 2周时，实验组及对照组生精细胞凋亡指数比较未见明显差异，实验组及对照组Bcl-2、CytC和caspase-3表达未见明显变化。有实验表明VC对睾丸的损害随时间进展而累积[8]，此时实验组与对照组凋亡指数无明显差异可能是因为VC对睾丸损害的累积效应尚不足以诱导生精细胞凋亡增加，或者睾丸组织通过多种机制产生代偿作用降低了VC对睾丸损害的累积效应使其不足以诱导生精细胞凋亡增加。ELV 4周时，实验组生精细胞凋亡指数及CytC、caspase-3表达较对照组显著升高，实验组Bcl-2表达较对照组显著降低。可见随着睾丸损害的时间累积效应增加，睾丸组织失代偿导致睾丸生精细胞Bcl-2、CytC和caspase-3表达显著变化，最终导致生精细胞凋亡增加。ELV 8周时，实验组生精细胞凋亡指数及CytC、caspase-3表达较ELV 4周组进一步显著升高，实验组Bcl-2表达较ELV 4周组进一步显著下降。可见随着睾丸损害时间累积效应的增加，对睾丸生精细胞Bcl-2、CytC和caspase-3表达的影响进一步增加、生精细胞损害较前进一步加重。有研究发现Bcl-2通过干扰CytC的释放阻断caspase蛋白酶的激活，从而抑制凋亡[5], 孙宝华等[9]发现Bcl-2不仅通过抑制CytC等进而抑制caspase-3的活化，还参与抑制caspase-3的合成。本实验中Bcl-2与CytC、caspase-3的表达随时间累积变化趋势相反，且变化存在同步性，与孙宝华等的研究发现一致。
本试验中，ELV大鼠生精细胞Bcl-2表达随时间显著下降，CytC、caspase-3表达随时间显著升高，ELV大鼠生精细胞凋亡指数随时间显著增大；Bcl-2与CytC、caspase-3的表达变化呈现同步性且趋势相反。可见，VC可通过多种机制影响Bcl-2表达，进而导致CytC、caspase-3的表达变化，使大鼠睾丸生精细胞凋亡增加进而影响大鼠的睾丸生精功能。
[参考文献]
[1] 许苑，彭弋峰.精索静脉对男性不育发病机制的研究[J].中国男科学杂志，2008，22(4)：66- 68.
[2] Saleh RA，Agarwal A，Sharma RK，et al. Evaluation of nuclear DNA damage in spermatozoa from infertile men with varicocele [J]. Fertil Steril，2003，80(6)：1431-1436.
[3] 张伟，周韧，陈培辉，等.Caspase-3、Bcl-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤组织的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系[J] ......
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