四种检测法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比较(2)
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参见附件。
1.3 统计学方法
实验数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，组间分析比较采用配对样本t检验，去蛋白率的比较采用χ2检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察结果
去除蛋白后的上清液较去除蛋白前比较颜色明显变淡，干燥后的样本有黄色固体物附着于管壁，用超纯水溶解于1.5 mL的EP管中，溶液澄清透明，如水样。其颜色深浅与蛋白浓度成正相关。
2.2 四种方法提取成功结果及耗时比较分析
四种方法对三种不同浓度的样本进行去蛋白的处理，每个样本进行四次独立实验，分别检测其去蛋白率。分析四种方法的实验成功率和耗时，四种方法的成功率均为100%，四种方法的耗时差异明显，方法Ⅲ通过建立实验对照组，通过调零，方便、快捷、耗时短(表2)。
表2 四种方法提取的实验结果
2.3 紫外分光光度法检测蛋白浓度
四种方法对三种不同浓度的样本进行去蛋白处理，通过紫外分光光度法检测样品去蛋白前后的蛋白浓度，并通过4次复实验分析去蛋白前后的蛋白浓度(表3)。
表3 紫外分光光度法检测分析个样本的蛋白浓度(x±s，ng/μL)
2.4 去蛋白率的分析
方法Ⅰ、Ⅱ和方法Ⅳ相比，差异无统计学意义(P > 0.05)，与方法Ⅲ比较差异有统计学意义(P < 0.05)。见表3。
2.5 标本蛋白浓度对去蛋白率影响的分析
标本蛋白浓度对去蛋白率的影响应用标本蛋白浓度的单因素方差分析表明，差异无统计学意义(P > 0.05)。可见标本蛋白浓度因素对去蛋白率无影响。
3 讨论
质谱鉴定蛋白技术已经比较成熟，样品有一定的纯度和浓度是得到比较准确的结果的前提条件，而高丰度蛋白的存在必然严重干扰小分子蛋白质的分离检测和鉴定[5]。理想的蛋白质去除技术应该是具有选择性的, 即能100%地去除不需要研究的高丰度蛋白质，同时又对拟研究的小分子蛋白质的含量或活性不产生影响[6-7]。乙腈去蛋白质法是一种快速的去除杂质蛋白质的方法，在研究中即时知道乙腈的去蛋白效果是每位研究者急切关注的问题。
综合以上四种检测乙腈去除高丰度蛋白质的方法，可以看出方法Ⅰ是种参考方法，通过低温冻干的方式将含低丰度蛋白质的溶液冻干，再用超纯水复溶检测计算乙腈的去蛋白率。方法Ⅱ是一种常用方法，但其耗时较长。方法Ⅳ通过挥干的方式去掉溶剂，在实验过程中对设备的要求较高且容易产生实验误差。本研究提示方法Ⅳ与其他方法相比，蛋白检测率差异明显，差异有统计学意义(P < 0.05)。通过比较，结果提示在实验中通过建立对照组，在紫外法检测蛋白浓度时使用对照调零去除乙腈对的干扰，可快速检测出乙腈的去蛋白效果。
[参考文献]
[1] Steel LF，Trotter MG，Nakajma PB，et al. Efficient and specific removal of album in from human serum samples [J]. Mol Cell Proteomics，2003，2(4)：262-270.
[2] Adkins JN，Varnum SM，Auberry KJ，et al. Toward a human blood serum proteome analysis by multid in ensional separation coupled with mass spectrometry [J]. Mol Cell Proteomics，2002，1(12)：947-955.
[3] 覃健，张志勇，何敏，等.两种去除血清高丰度蛋白方法的比较[J].预防医学情报杂志，2010，26(4)：322-324.
[4] 覃健，胡天桥，张志勇，等.乙腈沉淀法去除人血清中高丰度蛋白的探索性研究[J].中国卫生检验杂志 ......
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