食管鳞癌中T淋巴瘤侵袭转移诱导基因1、血管内皮生长因子和CD31的表达及其相关性研究(2)
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参见附件。
1.1 一般资料
收集2010年1月～2011年12月食管鳞癌手术后预留的新鲜标本作为观察组，标本术后立即取材，置于-80℃冰箱中冻存待检。纳入均符合WHO关于食管鳞癌的诊断标准，并经病理主治医师确诊。本组患者术前均未进行任何放化疗。本组共观察87例，年龄39～78岁，平均57.7岁，其中男47例，女40例。同时选取距肿瘤边缘5 cm外的正常食管黏膜组织标本72例作为对照组，取材及保存方法同上，本组中男40例，女32例，年龄40～78岁，平均56.9岁，两组在性别、年龄等相关因素的比较上差异无统计学意义(P > 0.05)，具有可比性。
1.2 主要试剂及流式细胞检测方法
Tiam1、VEGF和CD31抗体的浓缩液均购自Santa Cruz公司。依不同稀释比例进行预实验，选取最佳染色的比例进行实验。将冻存样本取出，放在75%的酒精中固定24 h后，取出组织放在不锈钢网上，用剪子搓碎后过滤，制备成单细胞悬液。取1 mL加入稀释后的蛋白，严格按实验要求的时间和顺序加入一抗和二抗，经铜网过滤后应用流式细胞仪进行[4]。流式细胞仪依据所适应的条件调整相应参数，用系统自带的软件进行荧光的半定量分析。
1.3 结果判断标准
采用荧光指数(FI)表示Tiam1、VEGF和CD31蛋白的表达量。FI值计算公式为：
FI=
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1.4 统计学方法
实验数据经Excel表格整理，应用SAS 6.12统计软件进行相关性检验，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示，比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Tiam1、VEGF和CD31在观察组与对照组中的表达
Tiam1、VEGF和CD31在观察组中的表达量明显高于对照组(P < 0.05)，见表1。
表1 观察组与对照组中Tiam1、VEGF和CD31蛋白表达的比较(x±s)
注：与对照组比较，*P < 0.05
2.2 Tiam1、VEGF和CD31在观察组不同临床特征中表达的比较
Tiam1、VEGF和CD31的表达与食管癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移及PCNA的增殖指数密切相关，见表2。
表2 Tiam1、VEGF和CD31在观察组不同临床特征中表达的比较(x±s)
2.3 Tiam1、VEGF和CD31在食管鳞癌中表达的关系
经Spearman等级线性相关性分析显示，观察组中Tiam1和VEGF(r = 0.45，P = 0.013 5)、Tiam1和CD31(r = 0.41，P = 0.036 4)、VEGF和CD31(r = 0.46，P = 0.010 8)的表达均具有正相关性。
3 讨论
食管鳞癌是实体肿瘤，其生长和转移均依赖于新生血管的形成。血管内皮生长因子的发现及应用推动了肿瘤血管生成的研究[5]。食管鳞癌是一种富含血管的恶性肿瘤，血管生成机制复杂，并涉及到多种基因和蛋白的作用[6]。CD31是特异性的血管内皮细胞标志物，能很好地标记肿瘤发生发展过程中形成的新生血管。Tiam1作为Rho蛋白家族重要成员，是Rac1的特异性鸟苷酸转换因子，能够催化底物分子中GDP/GTP转换，促进GDP的释放以及与GTP的结合，进而激活Rac1，调节细胞骨架结构重组，促进细胞运动和迁移，参与基因表达调控、细胞增殖与凋亡。其次，Tiaml还可以介导蛋白复合物的形成以及Tiaml蛋白的细胞膜的定位，诱导膜皱褶形成，促进肿瘤的运动功能。再次，Tiaml对Racl蛋白起到明显的活化作用，并对此通路具有正向调节的功能[7-8]。
流式细胞术检测客观性强，能准确地反应蛋白的表达程度。基于此，本实验通过流式细胞术半定量检测食管鳞癌中Tiam1、VEGF和CD31的表达特点，结果显示食管鳞癌中Tiam1、VEGF和CD31高表达，提示三者在肿瘤的发生中具有重要的促进作用；实验显示肿瘤中Tiam1、VEGF和CD31的表达均呈正相关，即Tiam1、VEGF和CD31可能具有正向协同作用。Tiam1可能通过Rac通路促进VEGF的高表达，进而促进CD31阳性血管内皮细胞的高表达，形成肿瘤性的新生血管。Tiam1也可能作为上游基因，直接调节VEGF的表达，促进血管内皮细胞的形成。Tiam1在诱导VEGF表达时增加，能明显增加肿瘤间质毛细血管壁的通透性，起到双重调节血管活性的作用。也有研究显示，当Tiam1引起VEGF的激活后，通过与细胞膜上特异性受体结合而发挥多种生物学效应，特异性地促进内皮细胞分裂增殖，改变内皮细胞的基因表达方式，增加微血管的新生[9-10]。本实验结果显示食管鳞癌中Tiam1、VEGF和CD31的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、分化程度及PCNA的表达密切相关，由于肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、分化程度及PCNA均与患者的预后及指导治疗相关，因此提示联合检测三种蛋白的表达可能对判断预后有一定价值。
总之，Tiam1、VEGF和CD31蛋白的高表达对食管鳞癌的进展有重要的促进作用，Tiam1可能通过诱导VEGF高表达促进CD31阳性的血管内皮细胞新生，进而促进肿瘤的进展。联合检测Tiam1、VEGF和CD31的表达可能与患者的预后相关。
[参考文献]
[1] 刘爱东.流式细胞术检测胃癌中血管内皮生长因子的表达及意义[J].中国中医药资讯 ......
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