高效液相色谱串联质谱法鉴定山银花水提取液的化学成分(2)
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2 方法与结果
2.1 样品提取
取山银花药材粉碎，称取10 g置圆底烧瓶中，加100 mL水，加热回流提取2 h，提取液冷却后转移至100 mL的容量瓶中，定容后过0.45 μm滤膜，待分析。
2.2 色谱及质谱条件
2.2.1 色谱条件 Hypurity C18高效液相色谱柱(150 mm×2.1 mm，5 μm)；流动相A为0.5 %甲酸，B为乙腈，梯度洗脱：0～5 min，98% A，2% B；6～30 min，2%～12% B；31～60 min，12%～28% B；61～80 min，28%～95% B；后运行10 min，98% A，2% B。流速为0.3 mL/min，进样量为5.0 μL，柱温为25℃。
2.2.2 质谱条件 电喷雾(ESI)离子源，负离子检测模式；喷雾电压为4.0 kV；鞘气(N2)流速：80个运移单位；辅助气(N2)流速：15个运移单位；碰撞气体：氦气；毛细管温度：350℃。质谱扫描范围为m/z 50～1 000，MSn碰撞能量为40%。
2.3 成分分析
山银花药材水提取液的HPLC-MS分析总离子流色谱图见图1。由图1可知，色谱图上有21个明显的色谱峰，通过与相关文献[7]比较每个色谱峰一级质谱信息、二级质谱信息以及C18色谱柱的洗脱顺序，其中的16个化合物得到了推测鉴定，这些化合物的保留时间、一级质谱、多级质谱和分子式见表1。再通过与对照品比较保留时间、一级质谱和多级质谱信息，化合物1、2、3、4、5、10、11、12、13和15分别确证为奎宁酸、柠檬酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C、异绿原酸A、异绿原酸B、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙。化合物6、7、8、14和16通过与相关文献比较推测为3-O-咖啡奎宁酸甲酯、断氧化马钱子苷、异槲皮苷、灰毡毛忍冬皂苷甲和灰毡毛忍冬次皂苷甲[7]。化合物9与化合物10、11、12具有相同的一级质谱信息，它们的多级质谱碎片信息也非常相似，提示它们具有相似的结构，因此推测鉴定为异绿原酸异构体。色谱图上的其他色谱峰由于缺乏相关的文献报道和对照品，结构有待进一步分析鉴定。
山银花中的咖啡奎宁酸类化合物的多级质谱裂解途径主要是咖啡酰基和奎宁酸连接的断裂，而黄酮苷和三萜皂苷类化合物的裂解规律主要是糖链的断裂，得到失去一个或多个分子糖的碎片信息，并且在多级质谱中能观察到苷元的碎片离子信息。
3 讨论
山银花作为常用中药，资源极为丰富，同时也是多种制剂的原药材。本实验通过对山银花水提取液进行了HPLC-MSn分析，研究了其水溶性的化学成分。根据各个色谱峰在质谱图中对应的准分子离子峰信息、碎片信息、质谱裂解规律和色谱保留规律，并参考相关文献，成功鉴定了16个化合物，并推测了化合物的质谱裂解机制。实验表明，HPLC-MSn技术能有效分析山银花中的有机酸类、黄酮类和三萜皂苷类成分。据文献报道，绿原酸和异绿原酸等有机酸类成分具有显著的抗病毒、调节糖脂代谢等作用[8-9]，异槲皮苷等黄酮类成分具有良好的抗炎活性，灰毡毛忍冬皂苷和川续断皂苷等三萜皂苷具有抗肿瘤活性[10]。该三大类成分都具有非常良好的药理活性，并且可通过水提的方式提取，而中药饮片主要采用水煎煮的方式服用，因此，这三类物质共同构成了山银花的药效物质基础。本实验为山银花药材的水溶性化学成分研究、药效物质基础研究、药理药效作用研究和药材的合理开发利用提供了准确有效的理论依据。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：28-29.
[2] 谷筱玉，陈振鹏，陈乾平，等.HPLC-UV-ELSD测定山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量[J].药物分析杂志，2011， 31(5)：884-887.
[3] 王振中，毕宇安，尚强，等.金银花与山银花挥发性成分GC-MS的研究[J].中草药，2008，39(5)：672-674.
[4] 贾晓东，冯煦，赵兴增，等.灰毡毛忍冬的化学成分研究[J].中草药，2008，39(11)： 1635-1636.
[5] 邢俊波，李萍，温德良.不同物候期金银花中总绿原酸的积累动态研究[J].中国中药杂志，2001，26(7)：457-459.
[6] 柴兴云，李萍，唐力英.山银花化学成分研究[J].中国中药杂志，2004， 29(9)：865.
[7] Ren MT，Chen J，Song Y，et al. Identification and quantification of 32 bioactive compounds in Lonicera species by high performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry [J] ......
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