茉莉酸甲酯对贯叶连翘中芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、槲皮素含量的影响(2)
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1.2 茉莉酸甲酯的处理
1.2.1 5 mmol MeJA溶液的配制 MeJA溶于2%(V/V)的乙醇水溶液中，由于MeJA微溶于水，配制时准备一定量的无水乙醇溶解MeJA，必要时可采用超声波促溶，再加H2O定容。对照溶液为2%(V/V)的乙醇水溶液。
1.2.2 MeJA处理组 培养至60 d时，选取生长状况良好、长势一致的贯叶连翘植株进行叶面喷施，处理浓度为5 mmol MeJA溶液。试验处理开始于上午8∶00，每棵植株约喷洒适量MeJA溶液，以控制溶液均匀覆盖所有叶片。由于MeJA易挥发，喷施后应立即蒙上保鲜袋，放入培养箱中。喷施处理后于0、1、2、4、6、8、10 h取样，清洗，液氮保存后放入-80℃冰箱中保存待用。
1.2.3 对照组 以上述处理组对应条件下的2%(V/V)的乙醇水溶液处理作为对照组，处理及材料收集方法同上。注意在处理过程中处理植株与对照植株要完全隔离，以避免飘逸的MeJA影响试验结果。
1.3 样品的制备及色谱条件
将待测样品于液氮下研磨，称取20 mg于1.5 mL离心管中。加入1 mL 80%的甲醇，超声提取40 min，然后5 500×g离心3 min，取上清液，最后用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测样品溶液。
色谱条件为固定相采用Phenomenex硅胶基质C18色谱柱(5 μm×4.6 mm×250 mm)。流动相参考Raffaella等[3]的方法，略作修改。波长参考唐静等[4]结果，确定最佳检测波长为270 nm。流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm；进样量：20 μL；流动相：A为乙腈，B为甲醇，C为0.2%乙酸水。梯度模式见表1。
表1 流动相梯度模式(体积分数，%)
2 结果
MeJA处理结果见图1。由图1各成分含量的变化可以看出，在0～4 h内试验组植株的金丝桃苷、芦丁、槲皮苷和槲皮素含量都在上升，且均明显高于对照组，4～6 h内芦丁、槲皮苷和槲皮素含量也高于对照组，且芦丁和金丝桃苷的含量达到最大值。在6 h之后试验组各成分的含量略低于对照。这表明茉莉酸甲酯的处理确实在一个短时间内能够诱导贯叶连翘启动内在防御机制，有效刺激其次生代谢产物的迅速积累。
2.1 精密度考察
取同一份样品，按照相同的色谱条件，分别在0、4、8、10、16、24 h进样6次，计算样品中主要色谱峰保留时间和相对标准偏差(RSD)，结果显示各时间段主要色谱峰保留时间一致，且RSD均小于3.5%，表明HPLC仪器的精密度良好。
2.2 重复性试验
取同一份贯叶连翘样品，相同的方法处理成5份，比较5次重复主要色谱峰保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)。经内标校正，5次重复主要色谱峰保留时间RSD均小于2.0%，峰面积RSD均小于3.5%，表明本方法重现性良好。
2.3 稳定性试验
取同一份样品，按照相同的色谱条件，分别在0 、4、8、16 h，24 h进样，考察其稳定性。大部分色谱峰的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)在16 h内均小于5%，在24 h内RSD小于10%，当样品放置24 h后，大部分代谢产物的衍生物逐渐不稳定，RSD超过了15%，因此样品应保证在16 h内测完。
2.4 HPLC含量测定试验
按照“1.3”项下色谱条件，检测试验组和对照组中各成分的含量，结果见表2。
2.5 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品50 mg，共6份。每份分别准确加入金丝桃苷、芦丁、槲皮苷和槲皮素标准品母液10 μL，按照相同的色谱条件进样分析，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，测得金丝桃苷、芦丁、槲皮苷和槲皮素的加样回收率(n = 6)分别为95.4%、96.2%、98.3%、101.2%、95.9%和99.2%，峰面积RSD均小于3.5%，表明此方法的准确性较高。
3 讨论
目前贯叶连翘在国外研究较多，而国内研究甚少[5]。但是贯叶连翘具有很长的药用历史，根据传统中医理论，其性平，贯叶连翘味辛苦涩，具有清心明目、舒经活血、止血生肌、解毒消炎、利湿之功效[6]。近年来，在欧洲和美国，大量使用从贯叶连翘中提取的物质制成制剂，用来治疗抑郁症。相关文献[7]还报道贯叶连翘具有抗肿瘤的活性。随着医药需求日益增长，提高贯叶连翘有效成分含量，培育优质新品种已经成为贯叶连翘资源开发必须解决的关键问题之一。
茉莉酸及其衍生物MeJA是一类新型的植物激素和信号分子，其广泛存在于高等植物体内，作为植物应对逆境胁迫和植物不同发育阶段的共同信号分子，可以激活细胞的防御反应，并诱导次级代谢产物的积累，发挥重要作用。研究表明外源喷施MeJA具有一定的逆境胁迫和调节效应，能够诱导植物体启动内在防御机制，有效刺激植物次生代谢产物的迅速积累[8]。这种有效调控植物次生代谢产物的生物合成，提高植物性状和质量的策略有效监管和控制，愈来愈受到人们的关注。
试验利用茉莉酸甲酯能够诱导植物体启动内在防御机制的特性，对贯叶连翘作出处理。结果表明，适量喷洒低浓度MeJA激素可促使贯叶连翘次生代谢物质的合成，外源MeJA能在短时间内发挥效应，影响贯叶连翘中酚酸类和黄酮类各成分的含量。随着处理时间的延长，各次生代谢产物的含量均呈现出先增加后降低的趋势。在0～6 h内，经MeJA诱导，各类次生代谢产物的含量均高于对照。随后贯叶连翘叶片表面出现萎蔫状态，在6～10 h内，各次生代谢产物的含量略低于对照，可能由于MeJA处理启动了植物体的抗逆机制，使更多的代谢中间产物趋于次生代谢产物的合成，从而间接影响了地上部分的初生代谢和正常生长。
综上所述，本方法用茉莉酸甲酯处理贯叶连翘可以在一定程度上提高贯叶连翘次生代谢物的产量，方法简便、准确，重复性好，可用于在基因水平上探究贯叶连翘酚酸类合成的机制。
[参考文献]
[1] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上册.上海：上海人民出版社，1977：1489.
[2] 孙涓，余世春.槲皮素的研究进展[J].现代中药研究与实践，2011，25(3)：85-88.
[3] Raffaella F，Anna P，Anna B，et al ......
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