β—细辛醚通过PKA/CREB信号通路对快速老化痴呆小鼠脑组织凋亡机制的影响(2)
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参见附件。
2 结果
2.1 Morris水迷宫定位航行实验和空间探索实验结果
Morris水迷宫实验中，模型组与对照组比较，平台潜伏期缩短，原平台停留时间缩短，差异有统计学意义(P < 0.05)，说明模型稳定，可以用于实验研究。实验组、治疗组与模型组比较，潜伏期明显缩短，差异有统计学意义(P < 0.05)，实验组、治疗组与模型组比较，原平台停留时间延长，差异有统计学意义(P < 0.05)，提示β-细辛醚能改善快速老化小鼠的学习记忆能力、空间探索能力，增强小鼠的记忆力(表1)。
2.2 小鼠海马神经元PKA、CREB测定
小鼠海马神经元模型组与对照组比较，PKA、CREB 吸光度(A)数值明显降低，蛋白数量较少，差异有统计学意义(P < 0.05)，表明模型组PKA表达减少， CREB信号表达减少。动物给药后实验组与模型组比较，PKA 表达增多，CREB信号表达增多，差异有统计学意义(P < 0.05)，说明β-细辛醚对快速老化小鼠治疗有效(表2)。
2.3 光学显微镜观察小鼠海马神经元
倒置相差显微镜下观察，对照组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞清晰可见，细胞形状锥体形，细胞核清晰，细胞器丰富，可见明显的尼氏体，显示蛋白石合成旺盛(图1a)；模型组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形态不规则，呈现多边形，细胞核较小，核仁不清晰，细胞整体损伤严重，细胞质中细胞器较少(图1b)；治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形状锥体形或、长梭形，细胞器部分可以看到(图1c)；实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞少量损伤，细胞边界较清晰，细胞形态较完整(图1d)。
2.4 电子显微镜观察小鼠海马神经元
对照组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形状是锥体形，细胞器丰富，可见大量的粗面内质网，神经原纤维丰富、排列规则有序(图2a)。模型组则小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤严重，细胞体积缩小，细胞核周边结构混乱，脂滴较多，细胞器较少(图2b)。治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞结构清晰，细胞器清晰可见，线粒体丰富，异物颗粒较少(图2c)。实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤较少，细胞结构较完整，神经原纤维较丰富，突触小泡较多(图2d)。
3 讨论
AD是一种临床常见的老年性记忆障碍疾病，由多种原因造成，国内外对于AD病因并不很清楚，AD的产生与大脑海马神经细胞淀粉样蛋白沉积、胆碱能神经纤维损伤、老年斑沉积形成、神经胶质细胞增生、化学性突触结构改变、突触密度丧失、神经递质和神经调质的生成减少等[3]有关。祖国传统医学认为AD的发生是脾肾亏虚，痰湿阻滞，痰浊淤血所致，治疗上以调节脾肾亏虚为主，痰浊淤血为辅。
AD动物模型首推SAM-P/8小鼠，该模型是日本京都大学竹田俊男教授开发的一种较理想的快速老化小鼠模型，SAM-P/8小鼠模型寿命较短、老化较快、海马神经元变性坏死、小鼠脑皮质萎缩等病理改变典型，老年性痴呆是小鼠的主要症状特征。本文应用β-细辛醚观察对快速老化SAM-P/8小鼠PKA、CREB蛋白表达影响，快速老化小鼠Morris水迷宫实验表明，β-细辛醚可明显改善SAM-P/8小鼠学习和记忆能力，模型组与正常组比较，寻找平台潜伏期长，差异有统计学意义(P < 0.05)。实验组能缩短寻找平台潜伏期，与模型组相比，差异有统计学意义(P < 0.05)，说明β-细辛醚对SAM-P/8小鼠学习和记忆能力有所改善。
β-细辛醚还可以影响细胞Ca2+的代谢，通过刺激大脑海马神经元，细胞质内Ca2+浓度增加，导致第二信使cAMP浓度增加，激活蛋白质依赖的PKA磷酸化，磷酸化有活性的PKA能改善化学性突触结构功能改变[4-6]。活化的PKA可以磷酸化CREB 转录因子的转录，调节蛋白质表达，使各种信息可以长期保存，就会记住事件的发生过程。动物给药后实验组与模型组比较，PKA 表达增多，CREB信号表达增多，差异有统计学意义(P < 0.05)，说明β-细辛醚对快速老化小鼠治疗有效果。β-细辛醚可增强PKA蛋白的表达量，来维持大脑海马神经元PKA/CREB这种特殊的信号通路传导。
光镜下对照组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞清晰可见，细胞形状锥体形，细胞核清晰，细胞器丰富，可见明显的尼氏体，显示蛋白石合成旺盛；模型组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形态不规则，呈现多边形，细胞核较小，核仁不清晰，细胞整体损伤严重，细胞质中细胞器较少；治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞形状呈锥体形或长梭形，细胞器部分可以看到；实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞少量损伤，细胞边界较清晰，细胞形态较完整，这些显示β-细辛醚可改善老年性痴呆痴呆模型中大脑海马神经元的病理特点，增强海马神经元的学习记忆能力，减弱老年性痴呆的症状。电镜下模型组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤严重，细胞体积缩小，细胞核周边结构混乱，脂滴较多，细胞器较少。治疗组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞结构清晰，细胞器清晰可见，线粒体丰富，异物颗粒较少。实验组小鼠海马神经元脑组织锥体细胞损伤较少，细胞结构较完整，神经原纤维较丰富，突触小泡较多，电镜照片显示β-细辛醚能减轻痴呆小鼠大脑海马神经元的损伤。
综上所述，β-细辛醚对老年痴呆的PKA/CREB信号通路有明显的改善作用，β-细辛醚能增强该信号通路的传导，达到治疗老年性痴呆的目的。
[参考文献]
[1] Weiner MW，Aisen PS，Jack CR Jr，et al. The Alzheimer's disease neuroimaging initiative： progress report and future plans [J]. Alzheimers Dement，2010，6(3)：202-211.
[2] Latha Devi，Hindupur K. Mitochondrial trafficking of APP and alpha synuclein：relevance to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's and Parkinson's diseases [J]. Biochim Biophys Acta，2010，1802(1)：11-19.
[3] Reddy PH. Amyloid beta， mitochondrial structural and functional dynamics in Alzheimer′s disease[J] ......
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