氧化苦参碱减轻大鼠肝纤维化的机制研究(2)
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参见附件。
1.2.6 荧光显微镜观察OM-liposome在大鼠体内的靶向作用 将一部分HSCs接种于24孔板上，细胞密度为5× l05/mL，待贴壁后，以0.25% FBS-DMEM培养，95%潮湿空气的CO2培养箱里过夜，实验前弃去原培养液，荧光显微镜观察药物在HSCs内的分布。
1.2.7 细胞活性检测 细胞经消化后，反复吹打使其成为细胞悬液，稀释到细胞浓度为106/mL，吸取约1 mL细胞悬液至离心管中，加入1滴台盼蓝并轻轻摇匀，在约3 min内对所有细胞进行计数。死细胞被台盼蓝染成蓝色，而活细胞则为无色，并根据公式计算活细胞率：活细胞率=(活细胞数/细胞总数)×100%。
1.2.8 实验分组 将生长良好的HSCs用0.25%的胰蛋白酶消化后，接种于24 孔培养板中，细胞浓度为2×107个/孔，每8个孔中分别加入0.5 mg/mL RGD-OM-liposome；OM-liposome以及RGD修饰的空白脂脂质体(RGD-liposome)，并设对照组。
1.2.9 流式细胞仪分析HSCs凋亡情况 各剂型药物作用24 h后，细胞以胰酶消化，PBS清洗，将细胞悬液离心(800～1 000 r/min，5 min)，弃上清液，加1 mL PBS，缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇15 mL，使其终浓度为70%，冰浴30 min，4℃过夜；加入等量PBS 再洗2次，65 mg /L碘化丙啶(PI)避光， 4℃显色1 h，流式细胞仪检测。
1.2.10 电镜观察HSCs形态 取对数生长期的单层生长细胞，弃去瓶中培养液，用胰蛋白酶消化，将细胞移入10 mL离心管中，加4℃预冷的PBS至10 mL，吹打均匀，离心(2 000 r/min，15 min)弃上清，加入4℃预冷的2%戊二醛4 mL，4℃固定2 h，PBS漂洗3次，每次10 min，1%四氧化锇4℃固定30 min，PBS漂洗3次，用50%丙酮溶液室温下脱水10 min，弃脱水剂，加3 mL包埋剂包埋(按体积1∶1)，室温下静置30 min，弃去包埋剂，加纯包埋剂1 mL，室温过夜后，将明胶注满混合包埋剂，60℃烤箱烘烤24 h，使标本固化为硬块，切片后电镜下观察细胞形态。
2 结果
2.1 各组凋亡小体形成情况
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用透射电镜观察HSCs胞内凋亡小体的形成。结果发现，OM-liposome可促进HSCs胞内凋亡小体的形成；RGD则可进一步增加OM-liposome诱导HSCs凋亡小体形成的作用(图1)。
2.2 各组凋亡情况比较
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用流式细胞技术检测HSCs细胞凋亡情况。结果发现，OM-liposome可诱导HSCs凋亡，抑制DNA合成；RGD则可进一步增加OM-liposome诱导HSCs凋亡、抑制DNA合成的作用(图2)。
2.3 各组细胞活性观察
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入RGD-liposome、OM-liposome和RGD-OM-liposome，利用台盼蓝染色检测细胞活性。结果发现，随着浓度的不断升高，OM-liposome可显著抑制HSCs的细胞活性；RGD则可增强OM-liposome抑制HSCs细胞活性的作用(图3)。
2.4 OM-liposome和RGD-OM-liposome在HSCs中的分布情况观察
将模型大鼠肝组织中分离获得的HSCs在体外培养，分别加入FITC-RGD-OM-liposome和FITC-OM-liposome，利用荧光显微镜观察。结果发现，RGD可显著增加OM-liposome在HSCs中的分布(图4)。
3 讨论
OM对肝纤维化具有较好的疗效[1]，然而其机制尚不清楚。HSCs和细胞因子共同参与发挥了致肝纤维化的作用[2]。越来越多的研究证实，抑制活化的HSCs、诱导HSCs凋亡对有效控制肝纤维化起着至关重要的作用。
本研究中，笔者成功分离获得了HF大鼠肝脏HSCs并在体外培养；构建了OM-liposome，并将其作用于体外培养的HSCs。结果发现，HSCs胞内凋亡小体形成增加，处于DNA合成期的HSCs百分比数量明显降低，细胞活性明显下降，提示OM-liposome可诱导HSCs凋亡。
新型人工合成的RGD肽是一类含有RGD的短肽，是整合素与其配体结合的识别位点。由于细胞表面的整合素介导ECM与HSCs细胞膜受体结合，影响HSCs的生物学功能，RGD能够竞争性与整合素结合，不但减少ECM与HSCs黏附，还可作为HSCs的特异性配体[6]。本研究建立了RGD-OM-liposome并将其作用于体外培养的HSCs，结果发现，RGD可显著增加OM-liposome在HSCs中的分布。不仅如此，RGD亦可显著增强OM-liposome增加HSCs胞内凋亡小体、减少处于DNA合成期的HSCs百分比及抑制HSCs细胞活性的作用。
综上所述，本研究建立了OM-liposome和RGD-OM-liposome，通过体外实验证实RGD可促进OM-liposome在HSCs中的分布，从而增强其诱导HSCs凋亡的作用，提示OM可能通过诱导HSCs凋亡减轻肝纤维化。
[参考文献]
[1] Shi GF，Li Q. Effects of oxymatrine on experimental hepatic fibrosis and its mechanism in vivo [J] ......
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