RP—HPLC法测定益肺通络颗粒中岩白菜素的含量
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[摘要] 目的 建立益肺通络颗粒有效成分岩白菜素的含量测定方法。 方法 采用RP-HPLC法，Agillent高效液相色谱仪，Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；甲醇-水(20∶80)为流动相；流速为1 mL/min；柱温为30℃；检测波长为275 nm；灵敏度为0.05 AUFS。进样量10 μL。 结果 在该方法中，岩白菜素进样量在0.054～0.540 μg范围内有良好的线性关系，r = 0.999 06，平均回收率为98.53%，RSD为1.32%。 结论 本方法准确简便，准确，重复性好，可用于益肺通络颗粒中有效成分岩白菜素的含量测定。
[关键词] 益肺通络颗粒；岩白菜素；含量测定；高效液相色谱法
[中图分类号] R927 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)10(c)-0108-03
益肺通络颗粒由黄精、百部、天冬、鳖甲、白及、矮地茶、丝瓜络、紫花地丁、太子参、款冬花、大蓟11味中药组成，具有益气养阴、化瘀通络、去腐生新的功效，主治气阴两虚夹瘀型肺结核。处方中除鳖甲单煎外，其余十味药全部煎煮提取，合并二煎液浓缩制成颗粒。方中矮地茶化痰止咳，清利湿热，活血化痰。全株主含挥发油0.1%～0.2%，在去油后的残渣中分离得镇咳有效成分矮茶素1号(即岩白菜素，bergenin)和矮茶素2号，尚含2-羟基-5-甲氧基-3-十五烯基苯醌等化合物及三萜类化合物。其活性成分矮茶素1号对电刺激猫喉上神经所引起的咳嗽及氨水喷雾引起的小鼠咳嗽都有明显的止咳作用[1]；矮地茶有降低大鼠气管-肺组织耗氧量的作用，矮茶素1号作用于含硫氢基必需基团的酶体系，因而降低了组织呼吸；每日吸入二氧化硫产生慢性气管炎的大鼠，内服矮茶素1号有一定的预防及治疗作用，表现为杯状细胞减少、炎细胞浸润、肺气肿及肺萎缩程度减轻[2-3]。为控制益肺通络颗粒中矮地茶的质量，本文在综合相关色谱分析方法的基础上[4-7]，建立了益肺通络颗粒中岩白菜素的RP-HPLC含量测定方法，为益肺通络颗粒中矮地茶的质量控制提供了方法和依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Agillent高效液相色谱仪，色谱柱Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；超声波清洗器(KQ-600型)；万分之一电子分析天平。
1.2 试剂及样品
试剂：甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司，20110406)，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。岩白菜素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：1532-200202)。益肺通络颗粒(自制，批号：110605、110615、110625)
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适应性
Kromasil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；甲醇-水(20∶80)为流动相；流速为1 mL/min；柱温为30℃；检测波长为275 nm；灵敏度为0.05 AUFS，理论塔板数大于3 000，拖尾因子(T)为0.940。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的岩白菜素5.4 mg，用甲醇溶解制成0.054 mg/mL的对照品溶液，备用。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品颗粒约0.5 g，精密称定，置入50 mL量瓶中，加入甲醇40 mL，超声处理40 min，放冷后加入甲醇至刻度，滤过，取续滤液10 μL进样，测定。
2.2.3 阴性溶液的制备 按本品制剂工艺制备不含矮地茶的制剂，同供试品溶液制备方法制备，进样量同上，测定。各溶液色谱见图1。
2.3 线性关系考察
精密量取岩白菜素对照品溶液(0.054 mg/mL)1、2、4、6、8、10 μL进样。测定其峰面积，以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归，得标准曲线方程A=63.705 84C-1.775 24(r = 0.999 06)。以上结果表明，在0.054～0.540 μg范围内，岩白菜素峰面积值与进样量有良好的线性关系。
2.4 精密度试验
精密吸取上述对照品溶液8 μL，重复进样6次，测定岩白菜素峰面积，结果分别为497.22、510.34、509.00、504.60、508.24、507.02，RSD为0.94%。
2.5 稳定性试验
取供试品溶液(批号：110615)在0、1、2、4、8、24 h，分别进样8 μL，测定样品中岩白菜素峰面积，结果分别为175.47、176.54、175.64、177.67、178.40、174.48，RSD为0.83%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6 重现性试验
按拟定的含量测定方法，对同一批样品(批号：110615)分别制备供试品溶液，测得峰面积值并计算含量，RSD为1.47%，表明方法重现性良好。
2.7 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品(批号：110615)约0.1 g，分别加入对照品溶液(0.054 mg/mL)3 mL，按上述样品制备方法和色谱条件，制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪，计算回收率。见表1。试验结果表明，此方法可靠性良好。
2.8 样品测定
取3批样品，按供试品溶液制备方法操作，按拟定的色谱条件测定其峰面积，每批样品测定6份，结果取平均值，3批样品中岩白菜素的含量分别为1.76、1.67、1.84 mg/g，见表2。
3 讨论
矮地茶为本方主药之一，且用量较大，其功用化痰止咳，清利湿热，活血化痰，符合本方益肺通络的中医基本理论，岩白菜素为矮地茶的有效成分之一，故选择岩白菜素作为控制本品质量的指标成分。
在岩白菜素的高效液相色谱法试验中，在对岩白菜素进行全波长扫描中，发现该化合物有2个吸收峰，分别位于220 nm和275 nm，考虑流动相中甲醇在220 nm波长处对基线有影响，故试验中检测波长选择为275 nm[8]，参照《中国药典》2010年版[9]及相关文献[10-12]，流动相考察了甲醇-水(15∶85)，甲醇-水(20∶80)，甲醇-水(25∶75)等，系统流速设置为1.0 mL/min，试验结果显示用甲醇-水(15∶85)洗脱，出峰时间超过20 min，而用甲醇-水(25∶75)来洗脱则出现与其他峰相隔较近及基线不平现象，最后选用甲醇-水(20∶80)为流动相，色谱图中岩白菜素的保留时间为12 min左右，峰形较好，且无其他杂质峰干扰；供试品制备考察中，则对不同的超声时间(30、40、50 min)作了比较，结果表明40 min和50 min测得的含量相差不大，30 min得出的含量较低，故采用超声40 min为宜。试验结果表明该方法具有分离效果好、灵敏度高、准确度高等优点，可作为益肺通络颗粒的质控方法。
[参考文献]
[1] 吕修梅，王军宪.岩白菜属植物的研究进展[J] ......
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