采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究(2)
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参见附件。
1.6 统计学方法
使用SPSS 11.0 统计分析软件，计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析和χ2检验进行统计学分析组织学结果，对培养液中雌二醇和孕酮的测定采用GLM中重复测量的方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 卵巢皮质组织学分析结果
冷冻前后的组织切片在光镜下均可见到形态正常和闭锁的卵泡(图1)。冻融后各组卵巢组织中卵泡形态正常率低于F组(P < 0.05)。其中，SSV组原始和初级卵泡正常形态率最高(P < 0.05)，其次为MDS组和SLV组，后两组之间差异无统计学意义(P > 0.05)，TV组卵泡正常形态率最低(P < 0.05)(表1)。
2.2 卵巢组织的体外培养
经过体外10 d培养后，各组卵巢皮质的边缘变圆滑。光镜下各组卵巢皮质培养后均可见到存活卵泡，见图2。如图2所示，与新鲜未培养卵巢组织相比，培养后的各组卵巢组织中原始卵泡所占的比例均下降(P < 0.05)，生长卵泡(包括初级和次级卵泡)比例均上升(P < 0.05)。新鲜未培养组原始卵泡和生长卵泡的比例分别为85.96%和14.04%；TV组培养后为60.66%和33.34%；MDS组培养后为56.24%和43.76%；SLV组培养后分别为54.79%和45.21%；SSV组培养后为46.0%和54.0%。SSV组冻融组织体外培养后初级卵泡比例明显高于其他冷冻组(P < 0.05)，同时原始卵泡所占比例明显低于其他冷冻组(P < 0.05)。TV组培养后两类卵泡比例与其他各组之间比较，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，培养后MDS组和SLV组的两级卵泡所占比例组间比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。
2.3 培养液中激素的测定结果
体外培养的10 d中，与新鲜培养液相比，复苏后卵巢组织培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随着培养时间逐渐升高(图3A、3B)。SSV组雌二醇和孕酮平均浓度明显高于其他组(P < 0.05)。TV组的两种激素水平均显著低于其他各组(P < 0.05)。MDS组与SLV组之间比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。
3 讨论
玻璃化冷冻过程需要一个特殊的载体承载冷冻保护液和组织细胞，对于卵巢组织而言，载体需要一定的容积同时要尽量减少所需冷冻液的体积以提高降温速度。此外，当组织被浸入液氮中时，沸腾的氮气包裹在组织周围，由于其低导热性形成有效的绝热区从而减缓了降温速度[9]。由此可见，载体的选择要考虑上述多种影响因素。目前已有多种载体被实验性地应用于玻璃化冷冻过程，如冷冻管(cryovial)、开放式拉长麦管[10]、最小微滴法和不锈钢网筛等。
冷冻管被应用于卵巢组织的程序化冷冻，但因管壁较厚和所需较多冷冻液，导致降温速度慢，不能满足玻璃化形成的需要。在本研究中，冷冻管玻璃化组的正常形态原始卵泡仅为64.57%，冻存效果显著低于其他组。Yeoman等[4]使用直接微滴法玻璃化冷冻猴子的卵巢组织，复温后约70.4%的卵泡保存正常形态。本研究中也使用了该方法玻璃化冷冻人卵巢组织，复温后形态学检测可见约78.36%的原始卵泡保存了正常形态，低于新鲜组和SSV组；体外培养后，生长卵泡比例增加，但仍低于新鲜组和SSV组，提示直接微滴玻璃化对卵巢组织中原始卵泡的形态及发育潜能存在一定影响。
固相表面玻璃化法是近年新出现的一种有效、简便的玻璃化技术，曾成功用于玻璃化冷冻牛成熟卵母细胞[11]和羊卵巢组织[12]。与前述各载体相比，SSV法具有其独特的优势：首先，由于该方案是直接将组织置于已经在液氮中半悬预冷至-150～-180℃的固相表面，因而可以避免液氮蒸发产生气泡导致的热传导阻滞[13]；其次，SSV技术与液氮接触的相对面积更大，而且可以将冷冻组织所需的冷冻保护剂减至最少，从而提高降温速度，促进玻璃化的形成[12]。第三，应用此方法可以冷冻较大体积的卵巢组织，能在较短时间内完成大量卵巢皮质的冷冻保存。第四，在SSV方法中，因直接将载有组织的玻璃态微滴浸入37℃复温溶液中，可以很快复温，避免冰晶再形成的发生从而减少对组织细胞的损伤。目前在SSV方法中使用的预冷的固相表面材料多报道为铝箔，主要原因是铝箔兼具优良的导热性和延展性，且价格便宜，便于操作。
笔者曾率先将SSV技术用于保存人卵巢组织，并证实其冷冻效果与传统的程序化冷冻效果相当。在本研究中，进一步将SSV与其他载体(冷冻管、最小微滴法和不锈钢网筛)相比，探讨对解冻后卵巢组织中卵泡形态和体外生长能力及激素分泌功能的影响。结果显示，解冻后，SSV组约有84.70%的原始卵泡维持了正常的形态，虽稍低于新鲜卵巢组织正常形态率(约90.27%)，但与其他文献报道的冷冻后70%～90%的原始卵泡正常形态率大致相当[14-15]。冻融的卵巢组织培养后原始卵泡比例比新鲜未培养组降低，生长卵泡比例增加。SSV组生长卵泡比例明显高于其他玻璃化组，培养液中雌二醇和孕酮平均浓度亦高于其他玻璃化组 ......
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