采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究(1)
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[摘要] 目的 比较采用不同载体的玻璃化冷冻方案对人卵巢组织的卵泡形态、冻融后体外培养时卵泡生长和激素分泌能力的影响，寻找临床上简便易行且保存效果上佳的人卵巢组织玻璃化冷冻方案。 方法 将16例患者的卵巢组织切割成皮质小条后随机分配到新鲜组和不同载体玻璃化组，包括冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面玻璃化组。观察各组卵巢组织卵泡形态；冻融后的卵巢组织行体外培养，比较卵泡生长情况以及培养液中雌二醇和孕酮的浓度。 结果 冻融后各组原始卵泡正常形态率均低于新鲜组，差异有统计学意义(P < 0.05)。冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面组，原始卵泡形态正常率分别为(64.57±11.84)%、(78.36±7.62)%、(77.21±6.51)%和(84.70±5.03)%。固相表面组原始卵泡形态正常率明显高于其他玻璃化组(P < 0.05)。体外培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随培养时间逐渐升高。固相表面玻璃化组两种激素平均浓度明显高于其他玻璃化组。培养后卵巢组织中原始卵泡所占比例均较新鲜组下降，生长卵泡比例升高。固相表面玻璃化组培养后生长卵泡比例明显高于其他玻璃化组。 结论 固相表面玻璃化冷冻可以保存大部分原始卵泡的正常形态，并能较好地保存其体外生长和性激素分泌功能。该技术简便易行且冷冻效果好，适合人卵巢组织玻璃化冷冻的临床使用。
[关键词] 人卵巢组织；玻璃化冷冻；载体；固相表面玻璃化；体外培养
[中图分类号] R711 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(b)-0008-04
卵巢组织冷冻可以为卵巢早衰或癌症需要放化疗的患者提供恢复生育能力及内分泌功能的可能性[1]。玻璃化冷冻是近年来出现的一种新的冷冻方法，该技术将冷冻对象直接投入液氮中快速降温，避免冰晶形成，可以绕开组织内不同细胞成分对慢速冷冻参数要求不同的技术障碍，从而提高冷冻保存效果。玻璃化冷冻的降温速度直接决定冷冻保护剂能否形成玻璃态，而使用的载体是影响降温速度的最重要因素。虽然目前应用玻璃化方法冻存人卵巢组织已有陆续报道，其中采用的载体包括冷冻管[2]、开放式麦管[3]、最小微滴法[4]以及不锈钢网筛[5]等，然而究竟何种载体更适合人卵巢组织玻璃化冷冻，需进一步研究。固相表面玻璃化技术(solid-surface vitrification，SSV)是近年新出现的一种简便有效的玻璃化方法，笔者前期曾成功将其用于玻璃化冷冻人卵巢组织片，并取得了与慢速程序化冷冻相当的效果[6]。本研究的目的是比较固相表面玻璃化冷冻和其他载体相比，对人卵巢组织玻璃化冷冻的效果。
1 材料与方法
1.1 人卵巢组织标本的收集与预处理
卵巢标本取自2011年11月～2012年6月就诊于中山大学孙逸仙纪念医院妇产科、需经腹或行腹腔镜手术的16例患者，年龄21～40岁，平均(32.7±5.9)岁；有规律的月经史，无内分泌紊乱，无放化疗史，半年内无激素服用史，且卵巢囊肿直径<7 cm。其中，良性卵巢囊肿8例，子宫肌瘤5例，宫颈癌3例。所有患者均签署知情同意书，本研究得到了中山大学孙逸仙纪念医院伦理委员会的批准。
新鲜卵巢组织浸泡于含10%人血白蛋白+青链双抗的L-15培养液(Gibco公司)中，于体式显微镜下去除多余髓质后，切成约5 mm×1 mm×1 mm大小的皮质小条，随机分配到不同的实验组：新鲜组(F组)、冷冻管玻璃化组(TV组)、最小微滴玻璃化组(MDS组)、不锈钢网筛玻璃化组(SLV组)和固相表面玻璃化组(SSV组)。新鲜组直接以4%多聚甲醛液固定。
1.2 玻璃化冷冻和复苏过程
采用含有20%乙二醇(ethylene glycol，EG)+20%二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)的L-15溶液为玻璃化冷冻液。将卵巢组织依次浸泡于4℃ 25%、50%、75%和100%浓度的玻璃化冷冻液中逐步导入冷冻保护剂后，采用不同载体行玻璃化冷冻：①TV组将卵巢置于含有1 mL 4℃ 100%玻璃化冷冻液的无菌冷冻管中投入液氮；②MDS组用无菌的巴氏管将卵巢组织直接滴入液氮中；③SLV组将卵巢组织置不锈钢网筛上投入液氮中；④SSV组将卵巢组织置于已在液氮中预冷的铝箔上投入液氮中，在液氮面之下将卵巢组织收集入冷冻管中液氮保存。
复苏时将冷冻管从液氮中取出，静置10 s，除TV组将冷冻管置于37℃水浴中2～3 min取出卵巢组织外，MDS组、SLV组和SSV组打开冷冻管取出卵巢组织，将其依次转移到0.5、0.25和0.125 mol/L蔗糖溶液中，洗涤后于37℃培养箱中静置备用。
1.3 人卵巢皮质片的体外培养
卵巢组织体外培养体系参考文献[7]。将复苏的卵巢组织置于嵌入式培养皿Millicell-ORG(Millipore公司)上培养。培养液成分：α-MEM液，2.5%人白蛋白，1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠ITS(含有胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠)，500 mIU/mL重组人促卵泡生成素(rhFSH)以及青链双抗 ......
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