VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达(2)
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参见附件。
1.2.4 荧光定量PCR检测VEGF表达 以MOI值100浸染人肝癌MHCC97L细胞48 h后收集细胞。按Trizol裂解液说明书进行细胞RNA的抽提；按照逆转录试剂盒说明进行逆转录：取1 μg RNA，用oligodt18引物，42℃ 60 min，70℃ 5 min进行逆转录。VEGF上游引物5’-ACTGCCATCCAATCGAGACCC-3’，下游引物5’-TGAGGTTTGATCCGCATAATC-3’。内对照β-Actin上游引物5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’，下游引物5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’。按实时PCR试剂盒说明配制反应体系，反应置于荧光定量PCR仪中，设定程序：预变性95℃ 120 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s，40个循环；荧光信号实时检测。以MHCC97-空白组细胞为对照，采用2-△△CT(CT代表循环阈值)法计算相对定量。
2 结果
2.1 oligo连接入plenti6.3-MIR测序DNA
测序结果证实oligo已正确连接入plenti6.3-MIR，序列与预期序列完全一致(图1)。
2.2 RNAi慢病毒的包装
plenti6.3-MIG-200转染实验24 h后，在荧光显微镜下(×100)同一视野的荧光和可见光照片对比，可见大部分细胞发出荧光(图2)，说明转染成功。
2.3 RNAi慢病毒滴度测定
根据荧光显微镜和普通显微镜(×100)下同时观察plenti6.3-MIG-200病毒感染293T细胞，在荧光显微镜下，在加入10-8 mL病毒原液的孔中观察到表达绿色荧光的细胞分别为37、25和35个，则病毒的滴度为：[(37+25+35)TU/3]/1×10-8 mL=3.23×109 TU/mL。
2.4 荧光定量PCR检测VEGF表达
RNAi慢病毒对人肝癌MHCC97L细胞的浸染率大于90%(图3)，荧光定量PCR数据结果显示：MHCC97-200组RNAi慢病毒对VEGF基因的干扰效率达到72.2%(表1)。
3 讨论
RNAi是一种转录后基因沉默现象，具有序列特异性的特点，shRNA可被切割为小干扰性RNA(small interfering RNAs，siRNA)，大小一般为21～23个核苷酸，以siRNA作为引导序列，与其具有完全互补序列的同源mRNA，具有特异性抑制目的基因表达的功能，并且新产生的siRNA可形成沉默复合物，继续对mRNA降解，从而产生级联放大效应[4-5]。由于RNAi技术抑制目的基因表达的效果确切，并且具有穿透性高和级联式放大效应等特点，因而在基因功能研究中具有很好的应用前景[6]。
慢病毒载体是一种新的病毒载体系统，是在HIV-Ⅰ病毒的改造基础上形成的，其能够高效率地向动物或人的细胞系中导入目的基因，慢病毒载体具有明显的优点，其介导的目的基因可完全整合到宿主细胞的基因组中，发挥基因表达或沉默作用持续并且稳定，并且不随着细胞的传代而减弱，从而实现目的基因的长期表达[7]，这一点与目前常见的腺病毒载体、腺相关病毒载体和传统逆转录病毒载体相比具有显著优势。当慢病毒载体用于RNAi研究时，不但可以高效抑制目的基因的表达，同时还可以充分发挥其作为病毒载体的自身优势，是基因功能研究中的有力工具[8-10]。
笔者前期研究发现课题组的原研药物——参芪扶正注射液，可显著抑制人肝癌细胞MHCC97L的生长、侵袭能力，并能下调VEGF基因表达，为进一步明确VEGF基因是否是药物发挥抑瘤作用的关键，需要在体内外实验中实现VEGF基因在人肝癌细胞MHCC97L中“沉默”，以便在VEGF基因沉默状态下进一步研究药物抑瘤作用的变化。本研究成功构建了能转录产生VEGF shRNA的质粒，进而构建并包装产生高滴度的慢病毒RNAi载体，并有效整合至人肝癌MHCC97L细胞中，显著抑制了MHCC97L细胞中VEGF基因的表达，抑制率达72.2%，这将为今后从体内、体外系统研究VEGF沉默对参芪扶正注射液抑瘤作用变化的影响提供可靠的技术平台。
[参考文献]
[1] Suzuki H ......
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