VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达(1)
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[摘要] 目的 构建VEGF基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。 方法 根据人VEGF基因序列，设计并合成包含靶序列的互补DNA链，连接线性化的plenti6.3-MIR载体，构建miRNA慢病毒载体质粒，并转化至感受态细胞DH5α，进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞，包装生产慢病毒，测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L，用Real-time PCR检测RNAi组(MHCC97-200)、阴性对照组(MHCC97-NEGA)和空白对照组(MHCC97-空白)中VEGF的表达情况，确定其干扰VEGF表达的有效性。 结果 测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功，测定病毒的滴度为3.23×109 TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后，VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。 结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功，并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。
[关键词] VEGF基因；慢病毒载体；RNA干扰；MHCC97L细胞
[中图分类号] R318 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(b)-0011-03
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是特异性血管内皮细胞有丝分裂素，与受体结合后促进内皮细胞分裂、增殖、迁移，加速形成新生血管。研究表明，VEGF及其受体在肝癌癌组织中较正常肝组织呈过表达，并与肝癌的生长、转移、复发及治疗密切相关[1-3]。因此，VEGF已成为目前肿瘤抗血管治疗的热点。笔者前期研究发现课题组原研药物参芪扶正注射液可显著抑制人肝癌细胞MHCC97L的生长、侵袭能力，并能下调VEGF基因表达。为进一步明确VEGF基因“沉默”时药物作用的变化，本研究构建了能转录产生VEGF shRNA的质粒，进而构建并包装产生高滴度的慢病毒RNAi载体，并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达，抑制MHCC97L细胞中VEGF基因的表达，为进一步深入研究VEGF基因与参芪扶正注射液药物效果的关系奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
Platimum HIFI Taq Polymerase高保真扩增酶、Trizol Reagent、5×First-Strand buffer、0.1 mol/L dTT、SYBR Green I、Rnase out、oligo dT/Random primer/特异性引物、10×PCR Buffer、Mg2+(50 mmol/L)、Platinum Taq DNA Polymerase、100 mmol/L dNTPs(购自美国Invitrogen公司)；T载体、plenti6.3MIR载体、293细胞、DH5α感受态细胞、ddwater(购自上海诺百生物科技有限公司)；T4 Ligase(购自加拿大NEB公司)；DMEM培养基(购自美国HYCLONE公司)；FBS(购自法国biowest公司)；24孔和6孔细胞培养板(购自美国Corning公司)；荧光显微镜(购自日本Olympus公司)，荧光定量PCR仪(购自美国Bio Rad公司)。
1.2 方法
1.2.1 载体的构建和鉴定 针对人类VEGF基因mRNA序列(NCBI GenBank，基因编号：AF022375)，利用invitrogen公司BLOCK IT RNAi DESIGNER工具设计干扰序列如下，200-F：TGCTGTGAAGATGTACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA；200-R：TGCTGTGAAGATG
TACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA； Negative-F：TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT；
Negative-R：CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC。将2对oligo(包括阴性对照链)退火成双链。然后连接线性化的plenti6.3-MIR载体，构建2个miRNA慢病毒载体质粒，并转化至感受态细胞DH5α。挑选阳性克隆，用载体通用引物进行菌落PCR筛选。筛选得到的阳性克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。
1.2.2 RNAi慢病毒的包装 取对数生长期细胞293T细胞，按照每个10 cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中 ......
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