抑癌基因p14ARF对慢性粒细胞白血病细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响机制研究(1)
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[摘要] 目的 探讨抑癌基因p14ARF对慢性粒细胞白血病细胞的增殖、细胞周期及凋亡的的影响机制研究。 方法 应用慢病毒载体系统，将抑癌基因p14ARF导入慢性粒细胞白血病细胞系及患者来源的慢性粒细胞白血病细胞中，应用WST-8法检测细胞生长存活率，应用流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况。 结果 应用表达p14ARF的VSV-G假构型慢病毒载体可明显抑制慢性粒细胞白血病细胞增殖，诱导细胞凋亡，但对细胞周期没有明显的影响。 结论 利用p14ARF基因治疗可明显抑制慢性粒细胞白血病细胞的增殖。
[关键词] 基因治疗；p14ARF；慢病毒载体；白血病
[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(b)-0014-03
粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)其发病的分子生物学基础为Bcr-abl融合癌基因。过去分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼已经发展为慢性粒细胞粒细胞白血病的一线治疗，但仍然存在复发耐药等问题。因此探索新的治疗方法是目前亟待解决的问题。近年来发现p14ARF基因失活与肿瘤形成，特别与白血病形成密切相关。在复发耐药的CML细胞中通常可检测到Bcr-abl融合蛋白过表达及NF-κB通路异常活化[1-7]。p14ARF是一种抑癌基因，编码分子量为14kD的蛋白，该蛋白主要与癌蛋白MDM2结合，加速MDM2降解，恢复和稳定细胞p53水平，从而发挥细胞周期抑制功能，导致细胞衰老或凋亡。研究发现抑癌基因p14ARF缺失及癌基因Bcr-abl活化的同时存在，与肿瘤的发生、发展密切相关，故p14ARF位点可能成为CML理想的基因治疗靶点。2008年1月～2012年1月笔者将p14ARF基因导入CML细胞中，观察其对CML细胞的增殖、细胞周期及凋亡的调控作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
大量质粒提取试剂盒、凝胶DNA条带抽提试剂盒为QIAGEN公司产品。细胞培养基DMEM、RPMI1640、胎牛血清(FBS)、TA克隆试剂盒为Invitrogen公司产品。磷酸钙转染试剂盒为Amersham Pharmacia Biotech 公司产品。
1.2 细胞培养
K562细胞系按常规方法培养于含5%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置37℃的5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。4例CML患者来源的细胞在获得知情同意后从患者的骨髓获得，肝素抗凝，通过密度梯度离心法分离单个核细胞，细胞在液氮中保存直至应用，在基因转导前1 d复苏细胞，培养于含10%胎牛血清和10 ng/mL G-CSF的IMDM培养基中。
1.3 重组慢病毒载体的制备和转导
通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，用Pfx DNA聚合酶从人类成纤维细胞系WI-38 cDNA中扩增出p14ARF cDNAs，并且插入到Zero Blunt TOPO PCR 克隆载体中，测序后将p14ARF cDNA插入到第三代自身失活(self-inactivating，SIN)HIV(VSV)慢病毒载体质粒，应用PCR技术从phrGFP-N1质粒中扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因，插入到第三代SIN HIV(VSV)慢病毒载体质粒，并将已插入p14ARF、GFP基因的载体质粒，包装质粒pMDLg/p.RRE，pMD.G以及表达调节基因Rev的质粒pRSV-REV等4种质粒通过磷酸钙沉淀法共转染病毒产生细胞人胚肾细胞系293T，培养12 h后更换新培养基，48 h及72 h后回收细胞上清液，0.45 μm滤器过滤并通过超速离心法浓缩，-80℃冰箱冻存。通过感染HeLa细胞，应用流式细胞仪测定病毒滴度[8]，同样方法制备空载体及对照用GFP表达载体。用病毒载体感染K562细胞系及来源于CML患者的细胞(2×105)，置37℃ CO2培养箱中培养，2 h后以磷酸盐缓冲液(PBS)洗净细胞，培养于含20% FBS的IMDM培养基中，于基因转导3 d后应用流式细胞仪检测GFP表达阳性细胞，以GFP表达细胞百分比作为评价基因转导效率的指标。
1.4 细胞增殖试验
将细胞以[(0.5～1.5)×104]/孔接种于96孔板，实验设p14组及空载体组，用WST-8试剂盒评价细胞生存率。
1.5 细胞周期分析
基因转导72 h后回收白血病细胞，用PBS洗2次，以700 mL/L的预冷乙醇固定2 h以上，经磷酸钠-柠檬酸钠缓冲液抽提处理 ......
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