骨桥蛋白基因对大肠癌细胞增殖、侵袭及Akt磷酸化的影响(1)
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[摘要] 目的 探讨骨桥蛋白(osteopontin，OPN)基因对大肠癌细胞侵袭的影响及机制。 方法 以人大肠癌Colo 205细胞为模型，应用OPN基因小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染处理后，采用荧光实时定量PCR检测OPN基因 mRNA水平，采用软琼脂集落培养试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖能力，采用Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力，采用蛋白质印迹检测癌细胞Akt磷酸化水平。 结果 OPN转染组癌细胞OPN mRNA和蛋白水平明显被抑制，且与时间和浓度相关。与空白对照组比较，OPN转染组细胞所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少，且呈浓度依赖性。蛋白质印迹检测发现，OPN转染组细胞Akt磷酸化水平明显下调。 结论 OPN基因转染可明显下调大肠癌细胞的增殖和恶性侵袭能力，下调Akt磷酸化水平，是OPN基因转染下调癌细胞的增殖和恶性侵袭能力重要机制之一。
[关键词] 大肠肿瘤；骨桥蛋白；侵袭；Akt；磷酸化
[中图分类号] R735.3+4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(b)-0055-03
大肠癌(包括结肠癌和直肠癌)近年来在我国发病率逐年增高。由于诊疗技术限制级人群忽视，很多患者发现时即有转移。转移的方式主要有血行转移、浸润种植、淋巴结转移等，主要转移至肝脏、淋巴结、肺部、脑部、及骨等部位。如何从分子水平进行大肠癌转移机制的研究，可为干预阻断大肠癌转移提供一定的理论基础。近年发现，骨桥蛋白(osteopontinin，OPN)与许多恶性肿瘤的侵袭转移的关系具有重要的相关性[1-2]。但是目前尚不完全清楚该基因在人大肠癌细胞侵袭过程中的机制。2012年1月～2012年6月，本课题组借助于RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，以大肠癌Colo205细胞为模型，对其采用OPN基因小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染处理，探讨了对癌细胞生长和侵袭的作用，并从信号转导通路(Akt)方面探讨了分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
人大肠癌细胞Colo 205购自美国ATCC公司，本院组织细胞生物库冻存。OPN基因siRNA的正义链序列：GAA ACU CCC UGU AAA CUA A dTdT；反义链序列：UAA GUU UAC AGG GAG UUU C dTdT，由美国Dharmacon公司合成。Akt及磷酸化抗体购自美国Santa Cruz公司。其他RNA提前试剂(Trizol，RNase抑制剂)，和逆转录试剂(SSRTⅡ、Taq 酶)及转染试剂Oligofectamine购自美国Invitrogen公司。
1.2 细胞培养及转染处理
人大肠癌Colo 205细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1天，将浓度为1.0×105/mL的细胞接种于24孔培养板24 h后，待细胞长满60%～70%时进行转染。细胞分组：①空白对照组(Con-A)：未经任何处理的大肠癌细胞；②脂质体对照组(Con-B)；③错配siRNA体对照组(Con-C)；④不同浓度的siRNA组：10%胎牛血清的RPMI-1640中含不同浓度(6.25、12.5、25.0 nmol/L)的已用脂质体包埋的siRNA。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，进行试验。
1.3 OPN基因mRNA水平检测
根据文献[3]，采用荧光实时定量RT-PCR检测OPN基因mRNA水平。
1.3.1 RNA抽提 应用Trizol抽提细胞总RNA。弃尽培养液，加入0.5 mL的Trizol试剂，反复吹打，转移到1.5 mL的eppendorf 管中，加入0.2 mL的氯仿，振荡混匀15 s，室温放置5 min后， 4℃条件下15 000 g离心15 min，吸取上清置另一新的eppendorf 管中，加入0.5 mL Trizol试剂体积的异丙醇，混匀后室温放置10 min，4℃条件下15 000 g离心10 min，弃上清，沉淀加75%乙醇，7 500 g离心5 min洗涤1次，室温放置10 min左右，加入10 μL的0.1%DEPC水溶解，260 nm测光密度，用40 μg/mLOD计算RNA浓度，用0.1%DEPC水调节浓度至200 ng/μL ......
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