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编号:12352723
杨梅素抗肝肿瘤细胞HepG2作用及其机制的研究(2)
http://www.100md.com 2012年12月25日 卞杰 顾明 侯胜燕 贾强
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    参见附件。

     2 结果

    2.1 MTT法细胞死亡率和细胞增殖活力检测结果

    杨梅素单体化合物对HepG2细胞有明显的生长抑制作用,通过Bliss法测得杨梅素作用48 h后其IC50值为(32.18±2.31)μmol/L。由结果可知,细胞死亡率随杨梅素单体化合物的浓度的增加而增加。见图1。

    2.2 荧光染色后细胞形态变化结果

    60 μmol/L的杨梅素溶液作用前,细胞核表面光滑且具有均匀的荧光;而作用24 h后,细胞数目变少且形态变圆,细胞核皱缩和坏死细胞碎片清晰可见,荧光浓染致密,核膜边缘呈现新月状小体,具有典型的细胞凋亡特征,见图2、3。

    2.3 杨梅素对HepG2细胞株细胞比率及凋亡率的影响

    使用流式细胞仪利用PI染色法观察杨梅素对HepG2细胞株的细胞周期影响,结果表明,不同浓度杨梅素溶液显著影响HepG2肝癌细胞的细胞周期,其作用于HepG2细胞24 h后,与阴性对照组比较,G2/M期细胞比率明显增高,G0/G1期和S期细胞比率降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05),呈明显的量效依赖关系,其中30 μmol/L杨梅素组G2/M期细胞比率低于50 μmol/L杨梅素组,G0/G1、S期细胞高于50 μmol/L杨梅素组,差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表1。

    2.4 细胞周期相关蛋白Cyclin B1、p34cdc-2蛋白表达量变化结果

    三种不同浓度的杨梅素溶液作用于HepG2细胞24 h后,p34cdc-2蛋白的表达量未见变化,而CyclinB1蛋白的表达量明显上升,且呈现浓度依赖关系。见图4。

    2.5 不同浓度的杨梅素溶液对凋亡机制相关蛋白PARP和Bcl-2表达量的影响

    不同浓度(0、30、50 μmol/L)的杨梅素溶液作用于肝癌细胞HepG2细胞24 h后,Bcl-2蛋白的表达量锐减,并诱导半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的底物PARP蛋白(113 kD)水解为89 kD的特异性水解产物。见图5。

    3 讨论

    笔者通过多方面的试验数据证实,天然黄酮类化合物杨梅素对肝癌细胞HepG2细胞有生长抑制作用,并呈现良好浓度依赖关系。其中,流式细胞仪测定细胞凋亡率的结果表明,杨梅素对HepG2肝癌细胞的阻滞在G2/M期。另外,由Western印迹法检测推断,杨梅素通过增加Cyclin B1蛋白的表达量从而使HepG2肝癌细胞无法于分裂后期脱离,进而将其抑制于细胞G2/M期,结果与Annexin V-PI流式凋亡检测结果吻合。而在影响细胞周期的过程中p34cdc-2蛋白的表达量未见显著增加或减少,正是这一结论的佐证。

    Caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶,能特异性裂解天冬氨酸残基,在细胞凋亡信号传到中起着至关重要的作用。根据它在级联反应中的作用可分为线粒体途径和死亡受体途径。前者受线粒体内膜释放的细胞色素C的调控,而细胞色素C受凋亡相关蛋白Bid、Bax和抗凋亡蛋白Bc1-2,Bc1-XL等的调节,凋亡信号最终导致Caspase-9前体活化成Caspase-9,进一步激活下游的Caspase-3,最后降解底物如PARP,导致细胞凋亡。后者最终引起Caspase-8的活化,再直接作用于Caspase-3,使Caspase-3激活,从而诱导细胞凋亡[7-13]。而图5显示底物PARP降解和抗凋亡蛋白Bcl-2锐减的现象,因此笔者推断杨梅素的诱导HepG2肝癌细胞凋亡可能的作用机制为:参与线粒体途径的调控,通过活化Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白(如Bak、Bax等)使线粒体外膜通透性增加,进而激活Caspase-3,使其底物PARP水解,DNA产生片段化最后完成HepG2细胞凋亡过程。为使其得到进一步的证实,笔者认为接下来的研究可通过引入Caspase-3和Caspase-9抑制剂,尝试干预杨梅素影响线粒体途径的调控,并检测其量效关系。

    [参考文献]

    [1] 张秀娟,黄清玲,季宇彬.杨梅素的药理活性研究进展[J].天津药学,2008,20(5):57-59.

    [2] 韦伟,姜庆.杨梅素诱导膀胱癌细胞株BIU-87凋亡机制研究[J].重庆医科大学学报,2010,35(120):1791-1794.

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    [6] 郑玲,荆瀛黎.杨梅素诱导人肝癌HepG2凋亡机制研究[J].中国现代药物应用 ......

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