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编号:12352726
杨梅素抗肝肿瘤细胞HepG2作用及其机制的研究(1)
http://www.100md.com 2012年12月25日 卞杰 顾明 侯胜燕 贾强
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    参见附件。

     [摘要] 目的 探讨杨梅素对肝癌细胞HepG2的生长抑制和诱导凋亡作用及其作用机制。 方法 应用甲基噻唑蓝(MTT)比色法,测定杨梅素对HepG2细胞株活性的影响,检测其抑制HepG2细胞株的时间效应和剂量效应;应用形态学观察、HE染色和Annexin V-PI流式检测,测定杨梅素对HepG2细胞的凋亡作用,并进行细胞周期的分析,最后对杨梅素对细胞凋亡相关的蛋白p34cdc-2、Cyclin B1、Bcl-2和PARP的影响进行了研究。 结果 杨梅素对HepG2细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用,且呈时间依赖和剂量依赖性,表现为:细胞G2/M期阻滞,出现明显的凋亡峰;Bliss法测定杨梅素对HepG2细胞的IC50值为(32.18±2.31)μmol/L,30、50 μmol/L杨梅素对G2/M期细胞比率分别为(41.32±0.90)%和(80.07±0.90)%,差异有统计学意义(P < 0.05);p34cdc-2蛋白的表达量未见变化,而CyclinB1蛋白的表达量明显上升,Bcl-2蛋白的表达量锐减,并诱导半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的底物PARP蛋白(113 kD)水解为89 kD的特异性水解产物。 结论 杨梅素通过激活Caspase家族蛋白实现对肝癌细胞HepG2细胞株的增殖抑制及诱导凋亡作用。

    [关键词] 杨梅素;肝肿瘤细胞;HepG2;凋亡

    [中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(c)-0007-03

    [Key words] Myricetin; Liver cancer cell; Cell line HepG2; Apoptosis杨梅素(myricetin,MYR)是从天然植物藤茶(葡萄科蛇葡萄属中的一种野生藤本植物)、杨梅等树皮中提取得到的多羟基黄酮类单体化合物,主要存在于杨梅的树皮中,其中嫩叶茎叶中含量较高,具有显著的生物活性,如抗肿瘤、降低神经毒性、影响淋巴细胞活化和增殖、拮抗血小板活化因子(RAF)、抗氧化抗衰老、保肝退黄以及降血糖等作用[1]。其中,杨梅素在抗肝肿瘤方面的作用日渐备受关注[2-6]。近年来,国内不少学者对其抗肝癌作用机制方面做了大量的总结和研究[5-6],主要是介绍杨梅素能有效诱导肿瘤细胞的凋亡,然而,由于研究并不深入,未能从分子生物水平上阐释杨梅素的抗肿瘤机制。本文通过甲基噻唑蓝(MTT)法对细胞增殖活力进行检测、倒置相差光学显微镜下观察荧光染色细胞生长形态、Annexin V-PI流式检测HepG2的细胞生长周期以及进一步的DNA片段电泳等实验,表明杨梅素通过影响肿瘤细胞HepG2的生长周期诱导细胞凋亡从而发挥其抗肝癌作用,并深入揭示起作用机制与激活Caspase家族蛋白直接相关。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 仪器 Olimpus CKX41临床型倒置显微镜,德国MACSQuantTM流式细胞仪,上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-IⅡ型CO2细胞培养箱。

    1.1.2 试剂及耗材 人类肝癌细胞HepG2(购于广州市中山医科大学病理科),小牛血清(购于广州蕊特生物科技有限公司),杨梅素(由广州市中山大学药学院制备并提供,HPLC纯度高于95%),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(包括Caspase-3和Caspase-9)以及DNA引物试剂(均购于美国CST生物工程有限公司),RPMI1640和DMEM培养基(购于上海阳光生物技术有限公司),96孔培养板(购于广州市华粤行有限公司)。溴化乙锭、磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)、二甲亚砜(DMSO)、琼脂糖、MTT等其他试剂,均为分析纯,购于广州化学试剂厂。

    1.2 方法

    1.2.1 杨梅素溶液的制备 取杨梅素纯品适量,精密称定,用0.1%DMSO溶液溶解并稀释至杨梅素浓度为100 μmol/L;临用时DMEM培养液稀释。

    1.2.2 MTT法检测细胞死亡率和细胞增殖活力 以7 000/孔的密度接种于96孔板,每孔180 μL,培养过夜,静置,分别加入10 μL由0~60 μmol/L不同浓度的杨梅素单体化合物溶液,并设置阴性对照组。药物作用48 h后培养结束前4 h加入MTT,继续培养4 h后倾去培养液,加入DMSO 100 μL使溶解、显色,用酶联仪以570/630双波长测定,以杨梅素浓度(μmol/L)为横坐标,细胞死亡率(%)为纵坐标,绘制杨梅素对HepG2细胞增殖影响的曲线图,并利用Bliss法算出细胞抑制生长率达50%时的杨梅素的药物浓度,以IC50值表示。

    1.2.3 荧光染色细胞形态观察 从MTT法检测细胞死亡率的结果中,选定一定浓度的杨梅素单体化合物溶液。以100 000个/孔的细胞密度接种于6孔板(具有玻片)中,培养24 h后,加入选定浓度的杨梅素溶液,作用不同时间(分别为即刻和24 h) ......

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