N—乙酰半胱氨酸对肺微血管内皮细胞核因子κB活性影响的体外研究(1)
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1.北京军区总医院急诊科，北京 100700；2.北京军区总医院干一科，北京 100700；3.广州军区广州总医院ICU，广东广州 510010；4.北京军区司令部门诊部，北京 100041；5.解放军66011部队卫生队，北京 102600
[摘要] 目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对人肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子κB(NF-κB)结合活性和环氧合酶-2(COX-2)表达的影响机制。 方法 体外培养HPMEC细胞株，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测NAC对HPMEC增殖活化的抑制作用，分别采用NAC(1 mmol/L)处理1 h，肿瘤坏死因子α(TNF-α)(100 ng/mL)处理1 h，NAC+TNF-α联合处理。凝胶电泳移动抑制实验检测HPMEC NF-κB的结合活性；免疫蛋白质印迹检测相应的HPMEC胞质内NF-κB抑制蛋白(IκB-α)的表达；免疫细胞化学观察HPMEC NF-κB表达的核内转移；激光共聚焦检测NAC对HPMEC中COX-2表达的影响。 结果 NAC对HPMEC的增殖活化有明显抑制作用，NAC+TNF-α联合处理组吸光度值明显低于TNF-α处理组，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。TNF-α刺激后具有诱导HPMEC NF-κB结合活性，且IκB-α表达明显减弱，NAC处理组IκB-α表达高于TNF-α处理组，差异有高度统计学意义(P < 0.01)。TNF-α处理1 h后，HPMEC NF-κB的主要表达从细胞质转移至细胞核内；NAC预处理后联合TNF-α刺激，HPMEC NF-κB表达主要位于细胞质，出现核内转移极少。HPMEC经TNF-α处理后细胞内COX-2表达明显高于NAC+TNF-α联合处理组以及正常对照组，差异均有统计学意义(均P < 0.05)；而NAC+TNF-α联合处理组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。 结论 NAC 可抑制HPMEC增殖活化；NAC可抑制HPMEC NF-κB结合活性、减少核内转移发生和COX-2的表达。
[关键词] N-乙酰半胱氨酸；核因子κB；人肺微血管内皮细胞
[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2012)12(c)-0018-04
近年来研究发现，氧化应激反应可导致或加重脓毒症、组织器官纤维化等一系列疾病[1]。因此，抗氧化剂在重症感染性疾病等防治作用日益受到重视[2-3]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)为巯基化合物供给体，具有抗氧化损伤、清除氧自由基、抗炎、调节细胞代谢等作用，可降低脓毒症、多器官障碍综合征等病死率[4-5]。目前NAC对严重感染性疾病的保护作用还不明确，关于NAC对人肺微血管内皮细胞(HPMEC)核因子κB(NF-κB)的活性影响研究很少。本研究通过应用NAC和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对HPMEC进行干预，观察NAC对HPMEC NF-κB结合活性和环氧合酶(COX-2)表达的影响，初步探讨其在炎性疾病防治中的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
HPMEC细胞株(购自Clonetics公司)；高糖型DMEM培养基(购自美国GIBCO公司)；细胞培养板和培养瓶(购自美国Corning公司)；抗COX-2(购自美国Santa公司)；NF-κB、核因子抑制蛋白(IκBα)多抗(购自美国Sigma公司)；核蛋白提取试剂盒(购自美国Pierce公司)；NAC(购自美国Sigma公司)；TNF-α(购自美国Sigma公司)；ECL化学发光试剂盒(购自美国Pierce公司)；[α-32P]dATP(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)；激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司)。
1.2 方法
1.2.1 HPMEC的培养 含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中37℃、5% CO2条件下培养HPMEC。
1.2.2 四甲基偶氮唑盐(MTT)检测NAC对HPMEC增殖活化的抑制作用 细胞在含10%小牛血清DMEM培养基中生长至对数生长期时，更换为无小牛血清DMEM培养基继续生长24 h，培养的HPMEC细胞处于细胞周期G0期后分别予以NAC处理24 h(其终浓度分别为100、10、1 mmol/L)；TNF-α(100 ng/mL)处理24 h；NAC(10 mmol/L)、TNF-α(10 ng/mL)联合处理24 h。接种于96孔板内，每组设6孔，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。MTT法在酶联免疫检测仪上490 nm处测量各孔吸光度值(A值)。而正常对照组继续在含10%小牛血清DMEM培养基中生长相同时间，同时设置调零孔、空白对照孔。
1.2.3 凝胶电泳移动抑制实验(EMSA)检测HPMEC NF-κB的结合活性 参照文献并略修改。①胞质蛋白和核蛋白提取：HPMEC细胞分别予NAC(1 mmol/L)处理1 h；TNF-α(100 ng/mL)处理1 h；NAC和TNF-α联合处理(先予NAC预处理1 h ......
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