马钱子优化总生物碱的制备与评价(2)
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2.3.2.2 对照品溶液和供试品溶液的制备 按《中国药典》2010年版一部所述方法，各称取马钱子碱对照品10 mg、士的宁对照品10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加氯仿溶解定容。各取0.1 mL，用甲醇稀释至5 mL于同一5 mL容量瓶中，摇匀即得对照品溶液和供试品溶液，其中每1毫升含马钱子碱20 μg和士的宁20 μg。用氯仿将马钱子优化总生物碱溶解配制成10 mg/mL溶液，取适量用甲醇稀释、定容到25 μg/mL，进样分析。按《中国药典》2010年版方法，以对照品和供试品相应色谱峰面积值，采用外标一点法进行定量。色谱见图1，测定结果见表1，可见优化后士的宁的含量显著下降，马钱子碱与士的宁的比例为2.7∶1。
A.对照品；B.马钱子总生物碱；C.马钱子优化总生物碱； 1.马钱子碱；
2.士的宁；3.马钱子碱氮氧化物
2.4 马钱子优化总生物碱的急性毒性研究
小鼠18～22 g，雌雄各半。受试药物为马钱子总生物碱和马钱子优化总生物碱，给药途径为尾静脉注射。通过预实验确定100%死亡组剂量Dm和0死亡组剂量Dn，马钱子优化总生物碱组在Dm(9 mg/kg)和Dn(1.575 mg/kg)的剂量范围内设4个剂量组，分别为2.161、3.087、4.410、6.300 mg/kg (剂量等比级数1∶0.7)。马钱子总生物碱组在Dm(1.60 mg/kg)和Dn(0.272 mg/kg)的剂量范围内设4个剂量组，分别为0.385，0.549，0.784，1.120 mg/kg (剂量等比级数1∶0.7)。每个剂量组10只小鼠。按Bliss法计算的实验结果见表2。可见，优化后马钱子总生物碱的毒性显著下降，LD50比优化前提高了4.8倍。
2.5 马钱子优化总生物碱的抗炎作用评价
精密称取马钱子总生物碱(马钱子碱与士的宁含量比为1∶2)、马钱子碱、优化马钱子总生物碱(马钱子碱与士的宁含量比为1.8∶1)适量，用含20 %乙醇的PBS(pH＝7.4)溶解，浓度为1 mg/mL。
2.5.1 分组
实验小鼠随机分为7组，每组10只。分别为空白对照组；阳性组(云南白药酊)；马钱子总生物碱组；马钱子碱组；优化马钱子总生物碱高、中、低剂量组。
2.5.2 给药方案参照文献[9]
于小鼠右耳涂抹20 μL二甲苯，左耳作为对照不涂二甲苯，30 min后，于各组小鼠左右两耳涂抹相应的受试药物，空白组给予含20%乙醇的PBS，给药组给予优化马钱子总生物碱，一共涂抹药物3次，每次为80 μL，间隔10 min，最后1次给药40 min后将小鼠颈部脱臼处死，剪下左右两耳，用直径为6 mm的打孔器在左右两耳相同部位打下圆耳片并称重。结果见表3。
可见，马钱子优化总生物碱的有效剂量为6 mg/kg，马钱子优化总生物碱抑制耳肿胀的效果显著优于马钱子总生物碱。
3 讨论
本实验中显色液的pH值及吸收波长，对于用酸性染料比色法来测定总生物碱纯度时对测定结果有很大影响，此结论在前期已通过实验考察[6]，并确定最佳的pH值为7.2，测定波长为416 nm。总生物碱纯度的测定结果表明马钱子优化总生物碱的纯度很高，接近100%。
士的宁已经被证明抗炎镇痛效果较弱且毒性较强，例如有文献证明非士的宁马钱子总生物碱才是抗关节炎的主要有效部位[10]，因此将士的宁去除有利于减毒增效，但是要完全去除需要应用大孔吸附树脂上柱洗脱，周期长，效率低。前期研究表明马钱子碱和士的宁在50%乙醇中的溶解度分别为(455.40±0.03)和(1.60±0.03)mg/mL，溶解度相差近284倍，因此应用溶剂溶解分离就去除了绝大部分士的宁得到马钱子优化总生物碱，工艺简单，有利于推广应用。
药效学研究表明，与马钱子总生物碱相比，马钱子优化总生物碱经皮给药后对耳肿胀的抑制作用显著增强；而急性毒性试验结果也表明，静脉注射途径下，马钱子优化总生物碱的安全性提高了近5倍。这些试验结果均表明，马钱子优化总生物碱可以实现减毒增效，本研究结果与其一致。
[参考文献]
[1] 蔡宝昌，吴皓，杨秀伟，等.马钱子中16个生物碱类化合物13CNMR谱的数据分析[J].药学学报，1994，29(1)：44-48.
[2] 张婷，陈军，王玮，等.马钱子碱脂质体在大鼠体内的药物动力学研究[J].中华中医药学刊，2012，28(1)：69.
[3] 邹龙，桂卉，黄世超，等.不同粒径马钱子粉体中士的宁在大鼠体内的药物动力学研究[J].中华中医药杂志，2009，24(12)：1568.
[4] 贾旋旋，李文，李俊松，等.马钱子的毒性研究进展[J].中国中药杂志，2009，34(18)：2397-2399.
[5] 于智敏，王克林，李海玉，等.常用有毒中药的毒性分析与配伍宜忌[M].北京：科学技术文献出版社，2005：59.
[6] Chen J，Wang X，Qu YG，et al. Analgesic and anti-inflammatory activity and pharmacokinetics of alkaloids from seeds of Strychnos nux-vomica after transdermal administration：Effect of changes in alkaloid composition [J] ......
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