VEGF—A/VEGFR—2信号通路对胃黏膜癌变过程新生血管的调控作用(2)
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1.3.2.4 数据分析 Western Blot采用NIH Image J计算灰度值。
1.3.3 RT-PCR相对定量法
1.3.3.1 mRNA的提取 组织加Trizol试剂后匀浆，12 000 r/min离心后弃沉淀，加氯仿混匀，4℃ 12 000 r/min离心取上层水相至另一离心管中，加异丙醇混匀，4℃ 12 000 r/min离心弃上清，RNA沉于管底，加75%乙醇，振荡、沉淀，4℃ 8000 r/min离心弃上清，真空干燥5～10 min。用50 μL DEPC高压处理过的H2O溶解RNA样品，55～60℃ 5～10 min。
1.3.3.2 逆转录 将提取出的mRNA进行逆转录，成为cDNA模板：在微量离心管中加2 μg总RNA，补充DEPC ddH2O达11 μL。加50 μmol/L Oligo(dT)12～18 μL，混匀、离心。70℃加热5 min，将微量离心管插入冰浴1 min。在每管中加RT反应液13 μL(混匀分装)，总体积为25 μL，42℃反应60 min。cDNA产物置于-20℃保存。操作以试剂盒说明书为准。
1.3.3.3 PCR实验 以cDNA为模板，进行real time PCR实验。引物溶解：12 000 r/min离心5 min，用ddH2O溶解，配成2 μmol/L的工作浓度。反应液配制：引物常规终浓度设为200 μmol/L，采用20 μL中加1 μL的cDNA模板。扩增条件：95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 30 s→溶解曲线分析 ......
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